梅毒螺旋體（ＴＰ）抗體檢驗試劑盒及其制備和檢測方法技術

本發明專利技術涉及一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋體（ＴＰ）抗體檢驗試劑盒及其制備和檢測方法，屬于免疫分析醫學診斷技術領域。具體包括用ＴＰ重組抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封閉空白結合點，制成特異性ＴＰ探針－高聚分子微球；與待測標本共培養捕獲ＴＰ抗體，洗滌離心除去未結合的ＴＰ抗體，再加入熒光標記的抗人ＩｇＧ或ＩｇＭ抗體；使用流式細胞儀檢測微球的熒光強度，對受測抗體進行定性或定量分析。本方法具有靈敏度高、特異性強、穩定性好的優點，并可對標本進行微量、多價分析。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum ；TP) 抗體檢驗試劑盒及其制備和檢測方法，屬于免疫分析醫學診斷

技術介紹
梅毒近年來在我國的發病率呈逐年增加的趨勢。2010年4月份衛生部公布，在全 國27種法定報告的甲、乙類傳染病中發病數居前五位的病種依次為病毒性肝炎、肺結核、 痢疾、梅毒和甲型Hmi流感，其中梅毒排第三位，2009年為第四位，2005年為第五位。梅毒是人體感染蒼白螺旋體后發生的不僅僅局限于皮膚或生殖系統的慢性全身 性傳染病，主要經性接觸、母嬰、血液傳播。目前，檢測感染者血清梅毒螺旋體抗體是診斷梅 毒螺旋體感染的主要辦法，分非特異性反應素抗體方法和檢測特異性抗體方法兩大類。甲 苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)和快速血漿反應素試驗(RPR)試驗是目前國內采供血機構 篩查獻血者及醫院初步診斷可以患者的梅毒血清學方法。TPPA法為確診試驗，特異性高，但 是成本較高、操作繁瑣、結果易受主觀判斷影響及不適于批量標本檢測。，研究新的快速、簡 便、敏感且特異的診斷方法，對梅毒早期發現、治療和防止擴散有重要意義。流式微球載體技術是使用流式細胞術和高聚分子微球載體檢測生物分子的新技 術。該技術在微載體表面進行免疫吸附反應，通過流式細胞儀測量示蹤物的熒光強度，具有 高靈敏度、分辨率和穩定性的優點。另外，使用不同直徑和內置熒光的微球載體，可在同一 試管進行多價分析，形成高效檢測模式。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種基于流式微載體技術的梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒 及其制備和檢測方法，可進行包括TP在內多價抗體檢測。在檢測方法上有別于以往的固定 態的凝集、吸附，而是對流動的單個微球逐一高速檢測，具有高靈敏度、特異性和穩定性高 的特點，適用于梅毒螺旋體篩查和輔助診斷。本專利技術的技術方案一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗試 劑盒，其特征在于試劑盒的組分包括探針包被的微球載體、陰性對照血清、陽性對照血清、 熒光標記抗體和樣本稀釋液。其中所述的微球載體是一種高聚分子微球，材質是乳膠、硅、樹脂，或可塑性聚合 材料，直徑2-20微米，在其表面以共價鍵歐聯包被重組TP抗原。熒光標記抗體為連接熒光 物質的抗人免疫球蛋白抗體，包括(但不限于)羊、兔、鼠、雞抗人免疫球蛋白。一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋體抗體檢驗試劑盒的制備方法，在于1)微球載體的制備重組TP抗原與活化的高聚分子微球按比例混合，2_8°C孵育4 小時以上，用PBS緩沖液洗滌離心后，加入一定濃度的牛血清白蛋白封閉，孵育30分鐘，完 成流式微球載體的制備。2)其它組分的制備陰性對照血清是非TP患者(5-10例)的混合血清，陽性對照血清為經確診的TP抗體陽性血清，樣本稀釋液為含有小牛血清白蛋白(1%)的磷酸緩沖液 (PBS)。一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋體抗體檢驗試劑盒的檢測，在于借助流式 細胞儀檢測對TP抗體定性和定量檢驗，以及包括TP抗體在內的多價檢測。其中定性檢測是用陰性、陽性對照血清為參照，根據待測樣品的熒光強度判斷感 染與否，強度大于或等于陰性檢測值的2. 1倍時為陽性，小于時為陰性。定量檢測是使用一組已知濃度的陽性對照血清，以此制作標準曲線，用以對受測 樣本的定量分析。包括TP抗體在內指標作多價檢測，涉及使用不同直徑和不同內置熒光的微球載 體的混合。每種微球載體包被一種探針，可捕獲一種特異性配體，最后使用流式細胞儀分析 將其區分。上述所有檢測均借助流式細胞儀。有益效果本專利技術的試劑盒可進行包括TP在內的多價抗體檢測，既可定性檢測又 可定量檢測，借助流式細胞儀及計算機技術間接檢測待測抗體。其在靈敏度、特異性和穩定 性是現有技術所不及的。本專利技術經53例具有代表性的血清檢驗結果見表1、2，以健康體檢者為對照，FCMA 檢測抗TP-IgG和TP-IgM靈敏度為100%和75. 00%，特異度分別為100%和94. 74%。表1. FCMA檢測血清TP-IgG抗體陽性率 表2. FCMA檢測血清ΤΡ-IgM抗體陽性率 具體實施例方式1.本專利技術所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒組分實 施例(1)基因工程重組TP抗原包被的高聚分子球微載體(2)熒光標記抗人免疫球蛋白抗體(3)陰性對照血清(4)陽性對照血清(5)樣本稀釋液2.本專利技術所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體(TP)抗體檢測試劑盒制 備實施例(1)基因工程重組TP抗原包被的高聚分子球微載體微球載體的材質是乳膠、硅、樹脂、苯乙烯，溴苯乙烯，或丙烯酸，丙烯酸胺、甲基丙 烯酸鹽、氯化乙烯、氯化苯乙烯、乙烯醋酸鹽制成的聚亞胺脂和聚合性單體。用基因工程重 組T P抗原包被聚苯乙烯微球，2-8°C卵育4小時以上，PBS洗滌、離心除去未結合的包被抗 原，再用牛血清封閉白蛋白微球上的空白點，制成T P抗原特異性微球載體。(2)熒光標記抗人免疫球蛋白抗體熒光標記抗體，包括(但不限于)熒光標記的羊、兔、鼠抗人IgG、IgM、IgA。熒光 染料包括(但不限于)熒光素異硫氰酸(FITC)、四甲基若丹明、藻紅素蛋白(PE)、Cy-色素、 硫氰酸、葉綠素蛋白、羧基熒光素、碘化物、納米硅及其它生物或化學熒光染料。(3)陰性對照血清陰性對照血清是健康者的混合血清，可以稀釋一定倍數，例如50、100、500倍。(4)陽性對照血清陽性對照血清為經確診的梅毒抗體陽性血清，可以稀釋一定倍數，例如50、100、 500倍。熒光強度大于臨界值，稀釋倍數與陰性對照血清一致。(5)樣本稀釋液磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7. 2 士0. 2 ； 牛血清蛋白；0. 5%疊氮鈉 (NaN3)。3.本專利技術所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體抗體定性、定量及多價檢 測。定性檢測實施例臨界值(cut-off值)計算臨界值=陰性對照熒光強度 值X2. 1。測定樣本熒光強度值>臨界值，抗-TP抗體陽性；測定樣本熒光強度值<臨界 值時，抗-TP抗體陰性。定量檢測實施例方法是在試劑盒中配置4-5個不同濃度的陽性標準血清，例如 10、100、500、1000、2000ng/mL，用流式細胞儀制作濃度-強度標準曲線，橫坐標為熒光強 度，縱坐標為血清濃度，以此計算受測樣本中的TP抗體含量。多價檢測實施例將不同直徑微米的微球載體，分別包被上特異性抗原，然后將它 們按比例混合，在同一試管同步檢測不同配體。例如，同時測定梅毒、HIV、衣原體和支原體。4.本專利技術所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體(TP)抗體檢測試劑盒檢 測實施例①設定空白對照管(只加微球載體)、0標準管(加微球載體和標記抗體)、陰性 對照管(加陰性對照血清)、陽性對照管(加陽性對照血清)和若干待測樣本管(加待測樣 本)；②給所有管加樣本稀釋液90微升，微球載體10微升。③給陰性對照管和陽性對照管 分別加陰性和陽性對照血清2μ 1(1 50稀釋)，給待測樣本管加待側血清2μ 1(1 50稀 釋)，4°C培養30min。④給以上各管加磷酸緩沖液4毫升，離心(3500r/min，5min) 2次，倒棄 上清液。⑤給以上各管(除空白對照管)加羊抗人IgG-FITC(或羊抗人IgM-FITC) 1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋體（ＴＰ）抗體檢驗試劑盒，其特征在于試劑盒的組分包括：重組ＴＰ抗原包被的微球載體、陰性對照血清、陽性對照血清、熒光標記抗體和濃縮樣本稀釋液。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：林遠，王月華，
申請(專利權)人：南京工業大學，
類型：發明
國別省市：84[中國|南京]