【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體而言，涉及一種基于切刻酶輔助擴增技術與crispr結合的一體化核酸檢測方法。
技術介紹
1、聚合酶鏈式反應(pcr)通過從一個特定dna片段的單個副本中產生數百萬個dna序列副本，是實驗室核酸檢測的金標準。其主要原理是在熱穩定dna聚合酶的作用下，利用溫度循環實現引物識別和延伸，完成特定dna片段的體外擴增。僅需少量dna，在經過循環指數擴增后就可達到可檢測水平，這為分析人員的定量和定性分析提供了便利條件。但精確控制溫度循環需要精密的設備，這導致該方法只能集中在實驗室中進行。
2、近年來興起的等溫擴增技術填補了pcr技術的局限性，環介導等溫擴增技術(lamp)是利用嗜熱脂肪芽孢桿菌(bst)dna聚合酶在60至65℃的等溫條件下實現核酸大量復制的體外擴增反應，其可以在約30min實現目標核酸的檢測。重組酶聚合酶擴增技術(rpa)是另外一種極具潛力的恒溫擴增方法，rpa使用兩個引物于37～42℃的恒定溫度下在20～40分鐘內實現目標序列的指數擴增。常溫反應、簡單的程序和短的擴增時間使得rpa成為核酸檢測的有力技術。滾環擴增(rca)是一種作用于環狀dna分子的等溫擴增反應。rca利用具有鏈置換活性的phi?29噬菌體dna聚合酶來延伸與環狀dna模板退火的單個或多個引物。聚合酶的鏈置換活性允許新合成的dna模板置換先前產生的dna分子從而釋放ssdna，rca反應大多數是在37～40℃下約40分鐘完成。
3、切刻酶輔助擴增技術(near)是通過dna聚合酶和切刻酶的協同作用實現的核酸
4、為推廣near的應用，將near與其他分析方法結合使用，已經開發出具有各種信號輸出工具的核酸傳感器，如熒光、比色和電化學信號。near可以用cdte量子點作為熒光標記，分子信標可用作near反應的報告器，與其他放大方法結合開發超低檢測限雙擴增檢測方法。此外，near反應也可用于傳統可視化方法(如比色法)、經典的電化學dna傳感器系統的核酸檢測。但特異性效果仍然有限，因此需要開發更為精確地序列特異性分析方法。
5、近年來crispr/cas技術迅速發展，掀起了分子生物學領域的新變革，其高特異性、靈活、易于模塊化分析的特點受到廣泛關注，也逐漸被應用至擴增產物分析，成為新型的信號元件。crispr/cas體系主要通過cas效應蛋白與向導rna的相互作用調動體系的反應機制。所有cas效應蛋白都依賴crrna來引導對靶標雙鏈dna、單鏈dna或單鏈rna底物的互補鏈的識別與結合，以實現順式裂解活性。此外某些ii類cas蛋白如cas12a，cas12b，cas13a等具備反式切割活性，可以在cas效應蛋白順式切割活性激活的同時，激活其反式切割活性，任意切割蛋白存在環境中的單鏈dna或單鏈rna，這一現象已被應用于核酸快速檢測中。但其靈敏度有限，提高crispr/cas核酸分析靈敏度的一種手段是將靶標擴增，當與等溫擴增技術結合時將大大提高擴增產物檢測的序列特異性，有望提高檢測的特異性和靈敏度，同時實現現場可視化分析。
6、然而，當將crispr/cas技術與等溫擴增技術結合時，可能會出現一系列問題導致檢測失敗。第一，crispr/cas技術與等溫擴增技術反應成分不兼容，同時調節體系中的多個反應組分更可能導致檢測失敗。第二，由于cas效應蛋白強烈的順式與反式切割活性，會出現靶標和引物被cas效應蛋白過度消耗致使擴增失敗，從而使檢測失敗。在此過程中，不得不開蓋的兩步式操作還帶來了氣溶膠污染問題。因此，針對目前的現有技術中存在的開蓋污染、復雜的序列設計、繁瑣的操作步驟、較長的反應時間、反應體系不兼容等問題，亟需開發一種更準確、簡便、無污染的可視化擴增產物分析手段。
技術實現思路
1、crispr/cas體系的高度特異性靶標識別機制，為擴增條件苛刻的near體系提供了更優的產物分析途徑。其中如何解決兩個體系的不兼容性，near擴增效率與crispr/cas體系的切割效率差異是實現一體化的關鍵突破步驟，具有一定的挑戰性。因此，本專利技術的目的是開發出一種基于切刻酶擴增與crispr/cas12b結合的一體化核酸檢測方法，該方法反應效率高，并且可以在不打開反應容器的情況下進行檢測過程和結果判定。
2、針對現有技術的不足，在第一方面，本專利技術提供了一種核酸檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：
3、(1)針對待檢測目標dna設計含有切刻酶識別位點的內引物對和外引物對，所述內引物對對應的上游內引物和下游內引物按5’至3’順序包含三個部分：引物5’端為約11～13nt的隨機序列區，緊接是切刻酶識別區gagtcnnnn，其后是約13～18nt的模板特異性識別區，所述模板特異性識別區選取在目標dna序列中cas12b識別位點兩側；所述外引物對的上游外引物是位于距所述上游內引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物對的下游外引物是位于距所述下游內引物的下游3nt的16～20nt的序列；
4、(2)提取待測樣品的基因組dna；
5、(3)在所述基因組dna中一次性加入所述內引物對和外引物對、dntps、緩沖液、切刻酶、bst?dna聚合酶、靶向目標dna的sgrna、cas12b蛋白、熒光標記的單鏈dna報告子，以進行擴增切割一體化反應；
6、(4)根據熒光標記的單鏈dna報告子類型對反應產物進行光照激發，從而判斷所述目標dna是否存在。
7、在第二方面，本專利技術提供了一種核酸檢測試劑盒，其特征在于，包括：針對待檢測目標dna設計的含有切刻酶識別位點的內引物對和外引物對、dntps、緩沖液、切刻酶、bstdna聚合酶、cas12b蛋白、靶向目標dna的sgrna、熒光標記的單鏈dna報告子；
8、其中所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種核酸檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在(3)中，反應溫度為43～58℃，孵育5～30min；優選地，所述反應溫度為45～58℃；更優選地，反應溫度為57℃。
3.一種核酸檢測試劑盒，其特征在于，包括：針對待檢測目標DNA設計的含有切刻酶識別位點的內引物對和外引物對、dNTPs、緩沖液、切刻酶、Bst?DNA聚合酶、Cas12b蛋白、靶向目標DNA的sgRNA、熒光標記的單鏈DNA報告子；
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液包括Tris-HCl、BSA、Na+、K+、Mg2+；優選地，所述緩沖液包括30～80mM?Tris-HCl(PH＝7.9)，80～120mM?NaCl，80～120μg/mLBSA，5～20mM?Tris-HCl(PH＝8.8)，2～10mM(NH4)2SO4，70～100mM?KCl，5～15mM?MgCl2，0.05％～0.2％20；更優選地，所述緩沖液包括50mM?Tris-HCl(PH＝7.9)，90mMNaCl，90μg/mL?BSA，10
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法或試劑盒，其特征在于，所述熒光標記的單鏈DNA報告子序列為：5’6-FAM-TTATTT-3’BHQ1，通過對反應產物進行藍光照射來判斷所述目標DNA是否存在。
6.根據權利要求1-4任一項所述的方法或試劑盒，其特征在于，所述切刻酶選自Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nb.BtsI；優選地，所述切刻酶是Nt.BstNBI，所述切刻酶識別位點為GAGTCNNNN。
7.根據權利要求1-4任一項所述的方法或試劑盒，其特征在于，在目標DNA序列中Cas12b識別位點的兩側選取13nt作為內引物的模板特異性識別區，在此特異性識別區外側3nt處，選取16～20nt作為外引物；優選地，所述隨機序列區為11～13nt，所述模板特異性識別區為13～17nt；更優選地，所述隨機序列區為13nt，所述模板特異性識別區為13nt。
8.根據權利要求1-4任一項所述的方法或試劑盒，其特征在于，所述Bst?DNA聚合酶選自Bst?3.0DNA聚合酶，Bst?DNA聚合酶，大片段、Bst?2.0DNA聚合酶；優選地，所述Bst?DNA聚合酶是Bst?3.0DNA聚合酶。
9.根據權利要求1-4任一項所述的方法或試劑盒，其特征在于，所述內引物對濃度為0.1～0.5μM，外引物對濃度為0.1～0.5μM，sgRNA濃度為0.5～1μM，單鏈DNA報告子濃度為0.5～1μM，Cas12b蛋白為0.1～0.2μM，切刻酶為8～10U、Bst?DNA聚合酶為4～6U；優選地，內引物對濃度可以為0.1～0.3μM，外引物對濃度為0.2～0.4μM，sgRNA濃度為0.8～1μM，單鏈DNA報告子濃度為0.8～1μM；更優選地，內引物對濃度為0.1μM，外引物對濃度為0.2μM，sgRNA濃度為0.8μM，單鏈DNA報告子濃度為1μM，Cas12b蛋白為0.1μM，切刻酶為9U、Bst?DNA聚合酶為5U。
10.權利要求1-9任一項所述的方法或試劑盒的用途，其特征在于，其用于核酸檢測；優選地，用于檢測Omicron質粒基因組DNA，其中所述內引物對的序列如SEQ.ID.NO1、SEQ.ID.NO2所示，所述外引物對序列如SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4所示，所述靶向目標序列的sgRNA序列如SEQ.ID.NO5所示。
...【技術特征摘要】
1.一種核酸檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在(3)中，反應溫度為43～58℃，孵育5～30min；優選地，所述反應溫度為45～58℃；更優選地，反應溫度為57℃。
3.一種核酸檢測試劑盒，其特征在于，包括：針對待檢測目標dna設計的含有切刻酶識別位點的內引物對和外引物對、dntps、緩沖液、切刻酶、bst?dna聚合酶、cas12b蛋白、靶向目標dna的sgrna、熒光標記的單鏈dna報告子；
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液包括tris-hcl、bsa、na+、k+、mg2+；優選地，所述緩沖液包括30～80mm?tris-hcl(ph＝7.9)，80～120mm?nacl，80～120μg/mlbsa，5～20mm?tris-hcl(ph＝8.8)，2～10mm(nh4)2so4，70～100mm?kcl，5～15mm?mgcl2，0.05％～0.2％20；更優選地，所述緩沖液包括50mm?tris-hcl(ph＝7.9)，90mmnacl，90μg/ml?bsa，10mm?tris-hcl(ph＝8.8)，5mm(nh4)2so4，90mm?kcl，10mm?mgcl2，0.05％20。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法或試劑盒，其特征在于，所述熒光標記的單鏈dna報告子序列為：5’6-fam-ttattt-3’bhq1，通過對反應產物進行藍光照射來判斷所述目標dna是否存在。
6.根據權利要求1-4任一項所述的方法或試劑盒，其特征在于，所述切刻酶選自nt.bstnbi、nt.alwi、nt.bbvci、nb.btsi；優選地，所述切刻酶是nt.bstnbi，所述切刻酶識別位點為gagtcnnnn。
7.根...
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