吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)和制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)和制備方法，吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)是用下述方法制成：（１）將陽離子聚合物溶解在質(zhì)量濃度為０．１％－１０％的酸的水溶液中或溶解在水中制成陽離子聚合物溶液；將ＴＥ緩沖液與十六烷基三甲基溴化銨水溶液混合，制成Ａ溶液；（２）將濾紙浸沒于陽離子聚合物溶液中，浸泡，取出，用蒸餾水清洗，再放入Ａ溶液中浸泡，取出，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)，本發(fā)明專利技術(shù)使用了蛋白變性劑使其具有了抗菌活性。可以直接從吸附了生物樣品的該固體介質(zhì)上提取ＤＮＡ或應(yīng)用ＰＣＲ法進(jìn)行擴(kuò)增，用于醫(yī)學(xué)診斷，刑事現(xiàn)場(chǎng)取樣，物證保存，親子鑒定，生物樣品的郵寄以及流行病學(xué)的檢測(cè)等。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物載體制造領(lǐng)域，特別是涉及一種吸附儲(chǔ)存生物樣品中的DNA的介 質(zhì)和制備方法。
技術(shù)介紹
在室溫下對(duì)各種生物樣品進(jìn)行收集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和純化其核酸并進(jìn)行PCR、SNP分 析、STR分型以及限制酶解作用分析是目前在醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)學(xué)鑒定、流行病學(xué)預(yù)防檢測(cè)等 領(lǐng)域常用的操作技術(shù)和方法。對(duì)于生物樣品(特別是血液)中DNA的保存和運(yùn)輸通常需要 冷藏，其設(shè)備昂貴，操作步驟也繁瑣。更重要的是，由于沒有有效的方法防止樣品中的DNA 遭到破壞，所以樣品不能長(zhǎng)期保存。此外，由于冷藏保存的生物樣品中有一些細(xì)菌或病毒沒 被殺滅，對(duì)這些生物樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)檢測(cè)操作人員也是不安全的。在一些偏遠(yuǎn)、經(jīng)濟(jì)落 后的地區(qū)，病人血液樣品不能及時(shí)被檢測(cè)。因此，這些血液樣品如何保存及安全地運(yùn)輸?shù)綑z 測(cè)設(shè)備齊全的單位進(jìn)行檢驗(yàn)也是一個(gè)現(xiàn)實(shí)問題。鑒于這些問題，澳大利亞人Burgoyne專利技術(shù) 了“DNA儲(chǔ)存的固體介質(zhì)和方法”等一系列專利(US Pat 5,807, 527 ；US Pat 5,976, 572 ；US Pat5, 972，386 ；US Pat. NO. 5，497，562)，這些專利公開技術(shù)的核心內(nèi)容是以一種吸附性的 濾紙(例如美國(guó)Whatman 3匪濾紙或No. 1濾紙)為基質(zhì)，與一種弱堿(Tris)、一種螯合劑 (EDTA)、一種陰離子去垢劑(SDS)和尿酸結(jié)合，形成具有堿性pH值的產(chǎn)品，它可以吸附生物 樣品，特別是血液樣品。被吸附在該固體介質(zhì)上的血液樣品經(jīng)過洗滌可以提取DNA或進(jìn)行 DNA擴(kuò)增(PCR)。但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該專利技術(shù)制備的固體介質(zhì)在使用過程中DNA出現(xiàn) 大量丟失，因?yàn)檠簶悠坊蚱渌飿悠吩谶M(jìn)行PCR之前必須清洗掉雜質(zhì)和污染物，這是 生物樣品提取DNA或進(jìn)行DNA擴(kuò)增必須的步驟。由于在洗滌該樣品過程中大量的DNA被洗 脫而損失掉，極大地影響了繼續(xù)進(jìn)行的DNA擴(kuò)增過程。該專利技術(shù)中存在一個(gè)重要的問題是生 物樣品中的DNA是如何吸附在濾紙上？我們知道濾紙(包括美國(guó)Whatman 3M濾紙或No. 1 濾紙)的組成是純棉纖維或木質(zhì)纖維，這類纖維的表面動(dòng)電層電位是負(fù)的，而DNA分子也是 帶負(fù)電的生物大分子，特別是在堿性條件下。因此DNA分子與構(gòu)成濾紙的纖維素之間存在 著靜電排斥作用，該排斥力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于纖維素與DNA分子間的范德華力，使得在洗滌吸附有 血液的固體介質(zhì)時(shí)DNA大量丟失。而該專利中并未描述是否對(duì)該濾紙或纖維進(jìn)行了改造或 修飾。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供在常溫下能過吸附儲(chǔ)存DNA，為 后續(xù)DNA的純化和擴(kuò)增提供足夠數(shù)量模板的一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)。本專利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)的制備方法。本專利技術(shù)的技術(shù)方案概述如下一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)，用下述方法制成(1)按質(zhì)量比為1 1000-10的比例，將陽離子聚合物溶解在質(zhì)量濃度為0.1%-10%的酸的水溶液中或溶解在水中制成陽離子聚合物溶液；按體積比為1 1的比 例將TE緩沖液與質(zhì)量濃度為2% -10%的十六烷基三甲基溴化銨水溶液混合，制成A溶液；(2)將濾紙浸沒于所述陽離子聚合物溶液中，浸泡5-10分鐘，取出，用蒸餾水清洗 1-3次，再放入A溶液中浸泡5-10分鐘后取出，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)；或?qū)⑺鲫栯x子聚合物溶液噴淋在濾紙表面，使全部濾紙均勻噴濕，放置5-10分 鐘后再均勻噴淋A溶液，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)；或按質(zhì)量比為1 10-200的比例，將所述陽離子聚合物溶液加入均勻的造濾紙?jiān)?漿內(nèi)，攪拌均勻，放置5-15分鐘后，再加入A溶液，所述造濾紙?jiān)瓭{與所述A溶液的質(zhì)量比 為100-10 1，攪拌均勻，抄片，脫水，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)。所述陽離子聚合物為脫乙酰度為5% 99%的殼聚糖、羧基殼聚糖、羧甲基殼 聚糖、季銨化殼聚糖、烷基化殼聚糖、殼聚糖交聯(lián)物、接枝共聚殼聚糖、分子量為300 300, 000的多聚賴氨酸、分子量為400Da 75kDa聚乙烯亞胺、季銨化聚乙烯亞胺或聚乙二 醇化的聚乙烯亞胺。所述酸為醋酸、檸檬酸或馬來酸。所述濾紙為木漿濾紙或棉纖維濾紙。一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)的制備方法，由下述步驟組成(1)按質(zhì)量比為1 1000-10的比例，將陽離子聚合物溶解在質(zhì)量濃度為 0.1%-10%的酸的水溶液中或溶解在水中制成陽離子聚合物溶液；按體積比為1 1的比 例將TE緩沖液與質(zhì)量濃度為2 %-10 %的十六烷基三甲基溴化銨水溶液混合，制成A溶液；(2)將濾紙浸沒于所述陽離子聚合物溶液中，浸泡5-10分鐘，取出，用蒸餾水清洗 1-3次，再放入A溶液中浸泡5-10分鐘后取出，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)；或?qū)⑺鲫栯x子聚合物溶液噴淋在濾紙表面，使全部濾紙均勻噴濕，放置5-10分 鐘后再均勻噴淋A溶液，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)；或按質(zhì)量比為1 10-200的比例，將所述陽離子聚合物溶液加入均勻的造濾紙?jiān)?漿內(nèi)，攪拌均勻，放置5-15分鐘后，再加入A溶液，所述造濾紙?jiān)瓭{與所述A溶液的質(zhì)量比 為100-10 1，攪拌均勻，抄片，脫水，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)。所述陽離子聚合物為脫乙酰度為5% 99%的殼聚糖、羧基殼聚糖、羧甲基殼 聚糖、季銨化殼聚糖、烷基化殼聚糖、殼聚糖交聯(lián)物、接枝共聚殼聚糖、分子量為300 300, 000的多聚賴氨酸、分子量為400Da 75kDa聚乙烯亞胺、季銨化聚乙烯亞胺或聚乙二 醇化的聚乙烯亞胺。所述酸為醋酸、檸檬酸或馬來酸。所述濾紙為木漿濾紙或棉纖維濾紙。本專利技術(shù)用陽離子聚合物作為橋梁分子對(duì)普通濾紙進(jìn)行修飾，使得經(jīng)過修飾的濾紙 具有吸附、固定DNA的功能并能長(zhǎng)期保存，并使得在提取DNA過程中的洗滌步驟中DNA的損 失量降到極小，很好地適應(yīng)了后續(xù)DNA擴(kuò)增的要求。本專利技術(shù)的一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)中 使用了蛋白變性劑使其具有了抗菌活性。可以直接從吸附了生物樣品的該固體介質(zhì)上提取 DNA或應(yīng)用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，用于醫(yī)學(xué)診斷，刑事現(xiàn)場(chǎng)取樣，物證保存，親子鑒定，生物樣品 的郵寄以及流行病學(xué)的檢測(cè)等。附圖說明圖1為殼聚糖浸漬的濾紙收集和提取血液DNA用于STR結(jié)果。圖2為普通濾紙及本專利技術(shù)吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)收集的DNA做模板進(jìn)行PCR的結(jié)果。在圖2中M為DNA marker ；電泳2、3道為使用普通濾紙收集的血液提取DNA做模 板進(jìn)行PCR的結(jié)果；電泳1、4道為用本專利技術(shù)的吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)收集血液提取的DNA做 模板進(jìn)行PCR的結(jié)果；電泳5道為普通濾紙收集的唾液提取DNA做模板進(jìn)行PCR的結(jié)果；電 泳6道為本專利技術(shù)吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)收集的唾液提取DNA做模板進(jìn)行PCR的結(jié)果；電泳7 道為本專利技術(shù)吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)收集的血樣經(jīng)高溫高濕條件下儲(chǔ)存6個(gè)月后的PCR結(jié)果； 電泳8道為普通濾紙收集的血樣經(jīng)高溫高濕條件下儲(chǔ)存6個(gè)月后的PCR結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1一種吸附儲(chǔ)存DNA的介質(zhì)，用下述方法制成(1)稱取分子量5. 6萬、脫乙酰度85%的殼聚糖，用質(zhì)量濃度為的醋酸水溶 液配制成質(zhì)量百分比為0.5%的殼聚糖溶液；配制TE緩沖液(25mM Tris-H本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)，其特征是用下述方法制成：（１）按質(zhì)量比為１∶１０００－１０的比例，將陽離子聚合物溶解在質(zhì)量濃度為０．１％－１０％的酸的水溶液中或溶解在水中制成陽離子聚合物溶液；按體積比為１∶１的比例將ＴＥ緩沖液與質(zhì)量濃度為２％－１０％的十六烷基三甲基溴化銨水溶液混合，制成Ａ溶液；（２）將濾紙浸沒于所述陽離子聚合物溶液中，浸泡５－１０分鐘，取出，用蒸餾水清洗１－３次，再放入Ａ溶液中浸泡５－１０分鐘后取出，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)；或?qū)⑺鲫栯x子聚合物溶液噴淋在濾紙表面，使全部濾紙均勻噴濕，放置５－１０分鐘后再均勻噴淋Ａ溶液，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)；或按質(zhì)量比為１∶１０－２００的比例，將所述陽離子聚合物溶液加入均勻的造濾紙?jiān)瓭{內(nèi)，攪拌均勻，放置５－１５分鐘后，再加入Ａ溶液，所述造濾紙?jiān)瓭{與所述Ａ溶液的質(zhì)量比為１００－１０∶１，攪拌均勻，抄片，脫水，干燥，即制成一種吸附儲(chǔ)存ＤＮＡ的介質(zhì)。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葛志強(qiáng)，靳風(fēng)民，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：葛志強(qiáng)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：12[中國(guó)|天津]