一種利用ＲＰ－ＨＰＬＣ分析氨基酸的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用ＲＰ－ＨＰＬＣ分析氨基酸的方法，該方法包括步驟：取樣品溶液５０ｍｌ，以４０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清液２５ｍｌ，加入２５ｍｌ質量分數為２％的三氯乙酸，放于４℃靜置２ｈ，再以４０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清液２ｍｌ，過０．２μｍ微孔濾膜；取上述處理液０．５ｍｌ，加入ＤＴＤＰＡ溶液０．５ｍｌ，混勻，置８０℃水浴加熱１小時得保護液；設置自動進樣器進行柱前衍生：吸取保護液０．５μｌ，吸取０．５μｌ的ＯＰＡ，混合，吸取０．５μｌ的ＦＭＯＣ加入混合，再吸取水３２μｌ加入混合，進樣，梯度洗脫和檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于儀器分析
，具體地涉及一種利用反相高效液相色譜儀對樣品 中游離氨基酸進行分析的方法。
技術介紹
迄今為止，自然界中已發現180多種氨基酸，其中參與蛋白質合成的氨基酸只有 20多種，稱為基本氨基酸。由于氨基酸分析在蛋白質化學、生物化學、食品科學、臨床醫學等 領域的研究中起著重要的作用，因此，對氨基酸分析方法的研究與改進得到人們高度重視。 1958年，Spackman等首先提出了用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結合的方法分析蛋 白質中的氨基酸，實現了氨基酸分析的自動化，該方法就是氨基酸分析儀，但傳統的氨基酸 分析儀結構復雜，價格昂貴，而且一般都不能作其他分析使用。氨基酸含量檢測主要應用氨基酸自動分析儀和高效液相色譜(HPLC)。隨著HPLC 的發展，使用HPLC技術分析氨基酸獲得迅速發展，由于HPLC技術無需特殊反應裝置，具有 高效、簡便、快速、準確和價格低廉等優點，已在許多實驗室部分或全部代替了氨基酸自動 分析儀，廣泛應用于多種生物樣品內氨基酸的檢測。HPLC測定氨基酸的方法也很多，反相高 效液相色譜(RP-HPLC)檢測氨基酸的柱前衍生試劑就有近10種。呂艷等在《浙江農業科學》2006年第2期的“反相高效液相色譜定量分析多肽中 的氨基酸組成”中公開了蛋白質中氨基酸的檢測方法，部安珍在《安徽大學學報(自然科學 版)》1991年第3期的“ΟΡΑ柱前衍生法用于反相高效液相色譜分析氨基酸”公開了細胞色 素C酶解產物中氨基酸的檢測，上述文獻中公開的方法在定量和定性檢測氨基酸的時候都 具有缺陷，呂艷等的方法不能分析全部的氨基酸，對氨基酸分析的種類具有局限性，而鄔安 珍的方法同樣是不能對所有的氨基酸進行分析，其方法也存在局限性。本專利技術為克服現有方法的缺陷，提供了一種新的氨基酸分析方法。
技術實現思路
為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種利用反相高效液相色譜儀對樣品中游離 氨基酸進行定性、定量分析的方法，該方法包括如下步驟首先對樣品進行預處理，然后對樣品中的半胱氨酸的-SH進行保護，然后利用衍 生試劑OPA(鄰苯二甲醛)和FMOC(氯甲酸芴甲酯)分別對一級、二級氨基酸進行柱前衍生 化處理，然后進行反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析。其中一級氨基酸是指天門冬氨酸，谷氨酸，天門冬酰胺，絲氨酸，谷氨酰胺，組氨 酸，甘氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，瓜氨酸，精氨酸，丙氨酸，酪氨酸，胱氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，正 纈氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸或賴氨酸。二級氨基酸是指羥脯氨酸，肌氨酸 或脯氨酸。上述方法中，對樣品進行預處理的步驟為對樣品溶液進行離心，取上清液加入三氯乙酸，放于低溫靜置，再離心，取上清液過0. 2-0. 45um微孔濾膜，得樣品處理液；上述方法中，對半胱氨酸的-SH進行保護的步驟為將上述處理液與DTDPA反應，得保護液。更具體地的步驟是將上述處理液1份加 入1-5份的DTDPA溶液，混勻，置60-100°C水浴中加熱反應0. 5-2小時，得保護液。上述方法中，柱前衍生化處理步驟為用1-5倍保護液的ΟΡΑ、FMOC對保護液進行衍生，得柱前衍生處理液。上述方法中，反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析指是指通過流動相梯度洗脫，進 行雙波長檢測柱前衍生處理液，洗脫和檢測的條件為色譜柱C18或C8反相色譜柱流動相A 體積比為92-98 8_2的0. lmol/L醋酸鈉-乙氰溶液流動相B 體積比為3-6 2-1的乙氰-水溶液洗脫液流速0.5-2ml/min流動相的洗脫如表1 表1 流動相梯度洗脫表檢測波長338nm ( 一級氨基酸)，262nm ( 二級氨基酸)。具體地，上述反相高效液相色譜分析的條件是檢測是利用二極管陣列檢測器，OPA是指鄰苯二甲醛，其濃度為2. 5mg/ml,FM0C是 指氯甲酸芴甲酯，其濃度為10mg/ml，DTDPA是指3，3' _2_硫代-2-丙酸，其濃度為0. Ig/ ml, pH 為 10. 0。一級氨基酸是指如下表3中的1-22號氨基酸，二級氨基酸是指23-25號氨基酸。優選地，本專利技術提供了一種利用反相高效液相色譜儀對樣品中游離氨基酸進行定 性、定量分析的方法，該方法包括如下步驟(1)取樣品溶液適量，以4000r/min離心10-30min，取上清液，加入適量三氯乙酸， 放于0-10°C靜置0. 5-2h，再以離心處理，取上清液適量，過0. 2um-0. 45um微孔濾膜，得樣品處理液。(2)取上述步驟⑴得到的樣品處理液1份，加入DTDPA溶液1-3份，混勻，置 60-100°C水浴加熱0. 5-2小時，得保護液。(3)吸取步驟⑵得到的保護液1份，吸取1-3份0ΡΑ，混合，再吸取1_3份FM0C， 混合，再吸取50-100份水，混合，得柱前衍生處理液。(4)梯度洗脫和檢測洗脫液流動相A 醋酸鈉乙氰=92-98 8_2，調pH值至6_10 ；流動相B 乙 氰水=3-6 2-1 ；洗脫液流速0·5-2ml/min色譜柱C18或C8反相色譜柱洗脫時間和濃度如下表2: 表2 流動相梯度洗脫表檢測采取雙波長檢測，檢測波長為檢測一級氨基酸的波長為338nm，檢測二級氨基酸的波長為262nm，定性、定量分析繪制標準曲線，定性定量分析樣品液中的游離氨基酸。更具體地，本專利技術提供了一種利用反相高效液相色譜儀對樣品中游離氨基酸進行 定性、定量分析的方法，該方法包括如下步驟取樣品溶液50ml，以4000r/min離心lOmin，取上清液25ml，加入25ml三氯乙酸 (質量分數2% )，放于4°C靜置2h，再以4000r/min離心lOmin，取上清液2ml，過0. 2um微 孔濾膜；取上述處理液0. 5ml，加入濃度為0. lg/ml, pH為10. O的DTDPA溶液0. 5ml，混勻， 置80°C水浴加熱1小時；配置流動相A :0. lmol/L醋酸鈉乙氰=93 7，調PH值至6. 5 ； 流動相B:乙氰水=4 1 ；設置自動進樣器進行柱前衍生吸取樣品0.5ul，吸取0.5ul 的濃度為2. 5mg/ml的0ΡΑ，混合，吸取0. 5ul的濃度為10mg/ml的FMOC加入混合，再吸取水 32ul加入混合，進樣；梯度洗脫條件為色譜柱C18反相色譜柱；洗脫液流速2ml/min ；檢測波長為338nm和262nm。有益效果本專利技術的方法使用的系統配置是標準的液相配置，除氨基酸分析外，還可用于其 他分析工作，且具有檢測靈敏度高、樣品處理簡單、分析時間短、分析結果穩定、重復性好等 特點。本方法可對樣品液中25種游離氨基酸同步檢出，特別是對半胱氨酸先采用DTDPA 進行-SH保護后再與其他氨基酸一起進行同步衍生，檢測的種類多，效率高。附圖簡述附圖說明圖1 :25種氨基酸標準品分離色譜1是采用實施例1的方法對25種氨基酸標準品分離色譜圖，圖1中的1-25個 數字代表每種氨基酸的峰號，具體的峰號對應的氨基酸及其縮寫如下表3 表3 峰號、氨基酸和縮寫對照表具體實施例方式取樣品溶液50ml，以4000r/min離心lOmin，取上清液25ml，加入25ml三氯乙酸 (質量分數2% )，放于4°C靜置2h，再以4000r/min離心lOmin，取上清液2ml，過0. 2um微 孔濾膜本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用ＲＰ－ＨＰＬＣ分析氨基酸的方法，該方法包括如下步驟：　　取樣品溶液５０ｍｌ，以４０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清液２５ｍｌ，加入２５ｍｌ三氯乙酸（質量分數２％），放于４℃靜置２ｈ，再以４０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清液２ｍｌ，過０．２ｕｍ微孔濾膜；取上述處理液０．５ｍｌ，加入濃度為０．１ｇ／ｍｌ，ｐＨ為１０．０的ＤＴＤＰＡ溶液０．５ｍｌ，混勻，置８０℃水浴加熱１小時；配置流動相Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸鈉∶乙氰＝９３∶７，調ＰＨ值至６．５；流動相Ｂ：乙氰∶水＝４∶１；設置自動進樣器進行柱前衍生：吸取樣品０．５ｕｌ，吸取０．５ｕｌ的濃度為２．５ｍｇ／ｍｌ的ＯＰＡ，混合，吸取０．５ｕｌ的濃度為１０ｍｇ／ｍｌ的ＦＭＯＣ加入混合，再吸取水３２ｕｌ加入混合，進樣；梯度洗脫條件為：　　色譜柱：Ｃ１８反相色譜柱；　　洗脫液流速：２ｍｌ／ｍｉｎ；　　檢測波長為：３３８ｎｍ和２６２ｎｍ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄧莉，郝學財，邢海鵬，
申請(專利權)人：天津春發食品配料有限公司，
類型：發明
國別省市：12[中國|天津]