【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分析檢測(cè)，尤其涉及一種脂溶性維生素的檢測(cè)方法及試劑盒。
技術(shù)介紹
1、維生素(vitamin)是維持人體健康的必需微量元素，其以酶或輔酶的形式參與人體新陳代謝過程，調(diào)節(jié)人體的生長、發(fā)育。維生素a（va）、25-ohd2（25羥基維生素d2）、25-ohd3（25羥基維生素d3）、維生素e（ve）、維生素k1（vk1）是脂溶性維生素，因人體不能合成或合成的維生素極其微量，只能從食物中攝取。脂溶性維生素?cái)z取不足或缺乏，易導(dǎo)致人體生理機(jī)能、新陳代謝、細(xì)胞調(diào)節(jié)等障礙，誘發(fā)多種疾病。一般而言，成人均衡膳食無需額外補(bǔ)充脂溶性維生素，但特殊人群如孕婦、老年人、骨質(zhì)疏松患者以及兒童普遍缺乏維生素，若盲目補(bǔ)充大量，易蓄積致中毒。如早期妊娠婦女?dāng)z取大量維生素a增加?jì)雰撼錾毕蒿L(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于存在營養(yǎng)吸收障礙者、有肝臟疾病者以及炎癥性腸病者或生長遲緩兒童，應(yīng)常規(guī)監(jiān)測(cè)脂溶性維生素的濃度。對(duì)于這些特殊人群者，通常每6個(gè)月監(jiān)測(cè)1次，具體監(jiān)測(cè)頻率取決于疾病的嚴(yán)重程度。故科學(xué)、精準(zhǔn)的檢測(cè)人體脂溶性維生素含量，可準(zhǔn)確評(píng)估、篩查脂溶性維生素的異常狀態(tài)，針對(duì)性進(jìn)行個(gè)體化調(diào)整補(bǔ)充，提高維生素治療的安全性和有效性。
2、現(xiàn)有技術(shù)中，有關(guān)脂溶性維生素的檢測(cè)方法及試劑盒較多，但基本都是以液液萃取或者spe進(jìn)行前處理，使得前處理過程復(fù)雜、耗時(shí)較多，且大幅增加檢測(cè)的成本。
3、因此，如何提供一種前處理方法簡單、且能夠同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定五種脂溶性維生素的檢測(cè)方法以及配套使用的試劑盒，是本領(lǐng)域亟需解決的技術(shù)難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路<
1、基于此，本專利技術(shù)提供了一種通過蛋白沉淀法進(jìn)行前處理，然后聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)五種脂溶性維生素準(zhǔn)確檢測(cè)的方法，具體
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
如下。
2、首先，本專利技術(shù)提供了一種脂溶性維生素的檢測(cè)方法，包括：
3、將樣本與蛋白沉淀劑混合，離心后取上清液，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)；
4、所述蛋白沉淀劑包括甲醇、乙腈和二氯甲烷的混合液；
5、液相色譜的條件包括：
6、色譜柱為c18柱；
7、流動(dòng)相a為甲酸水溶液；流動(dòng)相b為甲酸甲醇溶液；其中，流動(dòng)相a中甲酸與水的體積比為（0.15~0.3）：100，流動(dòng)相b中甲酸與甲醇的體積比為（0.15~0.3）：100；
8、梯度洗脫程序如下：
9、
10、所有時(shí)間段流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積百分比之和為100%。
11、本專利技術(shù)通過對(duì)大量蛋白沉淀劑的篩選后，發(fā)現(xiàn)選擇甲醇、乙腈和二氯甲烷組成的蛋白沉淀劑能夠同時(shí)對(duì)多種脂溶性維生素（維生素a、25-ohd2、25-ohd3、維生素e、維生素k1）實(shí)現(xiàn)較好的蛋白沉淀效果，使得這些脂溶性維生素的提取效率獲得兼顧，通過一步蛋白沉淀后均達(dá)到較高的提取效果，有利于后續(xù)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)。
12、進(jìn)一步，本專利技術(shù)針對(duì)上述蛋白沉淀劑前處理后的樣本，對(duì)液相色譜的條件進(jìn)行適配研究，發(fā)現(xiàn)在上述液相色譜的條件下才能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種脂溶性維生素的精準(zhǔn)檢測(cè)，使得蛋白沉淀法聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)脂溶性維生素滿足線性、重復(fù)性、批間差、準(zhǔn)確度等方法學(xué)的各項(xiàng)要求。
13、更優(yōu)選地，流動(dòng)相a中甲酸與水的體積比為（0.15~0.25）：100，流動(dòng)相b中甲酸與甲醇的體積比為（0.15~0.25）：100。
14、最優(yōu)選地，流動(dòng)相a中甲酸與水的體積比為0.2：100，流動(dòng)相b中甲酸與甲醇的體積比為0.2：100。
15、優(yōu)選地，甲醇、乙腈和二氯甲烷的體積比為（70~80）：（10~20）：（5~15）。
16、優(yōu)選地，甲醇、乙腈和二氯甲烷的體積比為（72~78）：（12~18）：（8~12）。
17、在上述配比下，對(duì)多種脂溶性維生素的同時(shí)提取效果更好。
18、優(yōu)選地，梯度洗脫的流速為0.6~1?ml/min。
19、優(yōu)選地，色譜柱為c18柱，其規(guī)格為2.6?μm，30×3mm；
20、更優(yōu)選地，色譜柱采用kinetex?2.6μm?c18，30×3?mm。
21、優(yōu)選地，色譜柱的柱溫為35~45℃。
22、優(yōu)選地，所述檢測(cè)方法還包括：將樣本與蛋白沉淀劑以及內(nèi)標(biāo)物混合，離心后取上清液，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。
23、優(yōu)選地，所述樣本包括待測(cè)樣本、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品中的至少一種。
24、優(yōu)選地，所述待測(cè)樣本為血清。
25、優(yōu)選地，所述脂溶性維生素為維生素a、25-ohd2、25-ohd3、維生素e、維生素k1中的至少一種。
26、優(yōu)選地，所述樣本與蛋白沉淀劑的體積比為1：（4~6）。
27、優(yōu)選地，將樣本與蛋白沉淀劑混合，振蕩提取，離心后取上清液。
28、優(yōu)選地，在1500rpm以上振蕩提取5?min以上。
29、優(yōu)選地，在12000?rpm以上離心10?min以上后取上清液。
30、進(jìn)一步，本專利技術(shù)提供了實(shí)現(xiàn)上述任一檢測(cè)方法的試劑盒，包括如下組分：
31、校準(zhǔn)品c1~c6，質(zhì)控品1~3，內(nèi)標(biāo)濃儲(chǔ)液，蛋白沉淀劑以及流動(dòng)相添加劑；其中，
32、校準(zhǔn)品c1~c6中維生素a的濃度依次為：40~80?ng/ml、100~140?ng/ml、200~300ng/ml、500~700?ng/ml、1000~1500?ng/ml、2000~2500?ng/ml；
33、校準(zhǔn)品c1~c6中25-ohd2的濃度依次為：1~2.5?ng/ml、3~5?ng/ml、6~10?ng/ml、15~25?ng/ml、35~45?ng/ml、60~85?ng/ml；
34、校準(zhǔn)品c1~c6中25-ohd3的濃度依次為：2~5?ng/ml、6~10?ng/ml、12~18?ng/ml、35~45?ng/ml、75~85?ng/ml、150~165?ng/ml；
35、校準(zhǔn)品c1~c6中維生素e的濃度依次為：600~1000?ng/ml、1500~2000?ng/ml、3000~3500?ng/ml、7500~8500?ng/ml、15000~18000?ng/ml、30000~35000?ng/ml；
36、校準(zhǔn)品c1~c6中維生素k1的濃度依次為：0.1~0.25?ng/ml、0.3~0.5?ng/ml、0.6~1ng/ml、1.5~2.5?ng/ml、3.5~5?ng/ml、6~8.5?ng/ml；
37、質(zhì)控品1~3中維生素a的濃度依次為：100~200?ng/ml、800~1000?ng/ml、1500~2000ng/ml；
38、質(zhì)控品1~3中25-ohd2的濃度依次為：2~10?ng/ml、25~40?ng/ml、50~65?ng/ml；
39、質(zhì)控品1~3中25-ohd3的濃度依次為：8~15?ng/ml、50~70?ng/ml、100~125本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種脂溶性維生素的檢測(cè)方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，甲醇、乙腈和二氯甲烷的體積比為（70~80）：（10~20）：（5~15）。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，甲醇、乙腈和二氯甲烷的體積比為（72~78）：（12~18）：（8~12）。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，梯度洗脫的流速為0.6~1?mL/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，還包括：將樣本與蛋白沉淀劑以及內(nèi)標(biāo)物混合，離心后取上清液，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述樣本包括待測(cè)樣本、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述樣本與蛋白沉淀劑的體積比為1：（4~6）。
9.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于，包括如下組分：
【技術(shù)特征摘要】
1.一種脂溶性維生素的檢測(cè)方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，甲醇、乙腈和二氯甲烷的體積比為（70~80）：（10~20）：（5~15）。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，甲醇、乙腈和二氯甲烷的體積比為（72~78）：（12~18）：（8~12）。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，梯度洗脫的流速為0.6~1?ml/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：薛元強(qiáng)，張新星，栗琳，鄭佳，蘇營雪，丁沛瑜，周立，丁亮，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京豪思生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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