本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)及檢測(cè)方法，本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)成功構(gòu)建了一種功能性DNA引導(dǎo)的過(guò)渡態(tài)CRISPR/Cas12a微流控生物傳感器FTMB。FTMB中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)CRISPR/Cas12a策略利用具有特異性識(shí)別功能的DNA序列和激活劑來(lái)形成觸發(fā)開(kāi)關(guān)，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)crRNA和激活劑的組成比例，構(gòu)建了過(guò)渡態(tài)CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度目標(biāo)真菌毒素的高響應(yīng)。另一方面，F(xiàn)TMB的信號(hào)增強(qiáng)有效地集成了量子點(diǎn)的信號(hào)輸出和光子晶體的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物檢測(cè)，具體為一種基于crispr/cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)及檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
1、真菌毒素被認(rèn)為是引起食源性疾病的最重要原因之一，已受到全球的長(zhǎng)期關(guān)注。其中，黃曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏馬菌素b1(fb1)、t-2真菌毒素(t-2)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)是最常見(jiàn)的毒素。隨著公眾健康意識(shí)的提高，一些組織已經(jīng)設(shè)定了食品中真菌毒素的最大殘留限量(mrls)，以避免高風(fēng)險(xiǎn)行為。然而，大多數(shù)真菌毒素都是微量存在的，這對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。此外，多種真菌毒素共存于同一食品中的協(xié)同或拮抗作用增加了對(duì)人類(lèi)的毒性。面對(duì)物流全球化的發(fā)展趨勢(shì)，高效液相色譜法(hplc)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms)等傳統(tǒng)真菌毒素分析方法由于成本高、程序耗時(shí)、對(duì)專(zhuān)業(yè)技能的要求，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。因此，迫切需要建立一種靈敏、快速、準(zhǔn)確的多種真菌毒素高通量檢測(cè)方法來(lái)滿足當(dāng)前的新需求。
2、到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了一些生物傳感器用于真菌毒素的原位檢測(cè)。特異性分子識(shí)別元件主要是抗體和適配體，與抗體相比，適配體具有合成容易、成本低、熱穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，使其成為構(gòu)建生物傳感器的理想識(shí)別元件。通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化，已經(jīng)篩選出多種真菌毒素適配體。由于適配體穩(wěn)定的信號(hào)輸出和可編程性，將適配體轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)在生物傳感器中具有更廣泛的應(yīng)用前景。然而，它主要用于真菌毒素的競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定，因此，輸出熒光強(qiáng)度與分析物濃度呈負(fù)相關(guān)，或通過(guò)二次信號(hào)處理呈正相關(guān)，這犧牲了檢測(cè)精度。
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p>3、crispr/cas系統(tǒng)使真菌毒素和熒光信號(hào)之間建立直接的線性正相關(guān)成為可能。crispr-cas系統(tǒng)可以通過(guò)設(shè)計(jì)特定的引導(dǎo)rna鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)與匹配的rna或dna的結(jié)合，成為基于這一特征的理想分子檢測(cè)工具。crispr/cas12a系統(tǒng)基于cas12a酶，當(dāng)功能性dna遇到目標(biāo)分析物時(shí)，cas12a不加區(qū)分地切割周?chē)膯捂渄na(ssdna)探針。此外，cas12a對(duì)crrna靶dna錯(cuò)配的內(nèi)在耐受性較低，需要高度互補(bǔ)性，傳感器在捕獲目標(biāo)分子時(shí)不受界面空間的限制，顯著提高了識(shí)別效率。但是固相界面上的免疫識(shí)別受到比表面積、靶分子與界面之間緩慢擴(kuò)散過(guò)程以及靶分子與固相界面非特異性相互作用的限制，cas12a酶的非特異性側(cè)支切割活性限制了其在多靶點(diǎn)檢測(cè)系統(tǒng)中的應(yīng)用。因此，為了擴(kuò)展crispr/cas12a系統(tǒng)的吞吐量檢測(cè)策略，將其與多路復(fù)用微流控芯片相結(jié)合是一種可行的解決方案。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題為：cas12a酶的非特異性側(cè)支切割活性限制了其在多靶點(diǎn)檢測(cè)系統(tǒng)中的應(yīng)用，導(dǎo)致crispr/cas12a系統(tǒng)的檢測(cè)通量小；同時(shí)crispr/cas12a系統(tǒng)中與分子識(shí)別事件相關(guān)的標(biāo)簽的信號(hào)強(qiáng)度低，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度較低。
2、本專(zhuān)利技術(shù)為了實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的高通量超靈敏檢測(cè)，構(gòu)建了一種功能性dna引導(dǎo)的過(guò)渡態(tài)crispr/cas12a微流控生物傳感器(ftmb)，ftmb中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)crispr/cas12a策略利用具有特異性識(shí)別功能的dna序列和激活劑來(lái)形成觸發(fā)開(kāi)關(guān)，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)crrna和激活劑的組成比例，構(gòu)建了過(guò)渡態(tài)crispr/cas12a系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度目標(biāo)真菌毒素的高響應(yīng)。另一方面，ftmb的信號(hào)增強(qiáng)有效地集成了量子點(diǎn)(qds)的信號(hào)輸出和光子晶體(pc)的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。
3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：
4、本專(zhuān)利技術(shù)的第一個(gè)技術(shù)方案是：
5、一種基于crispr/cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，所述的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)黃曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏馬菌素b1(fb1)、t-2真菌毒素(t-2)或者脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)中的任意一種或幾種組合；
6、所述的檢測(cè)系統(tǒng)中包括針對(duì)各個(gè)真菌毒素的以下物質(zhì)：
7、4)適配體-1、激活子、適配體-2構(gòu)成的復(fù)合物；
8、5)crrna；
9、6)探針；
10、其中，針對(duì)afb1，crrna的序列為：seq?id?no：1，適配體-1的序列為：seq?id?no：
11、2，激活劑的序列為：seq?id?no：3，適配體-2的序列為：seq?id?no：4；
12、針對(duì)ota，crrna的序列為：seq?id?no：5，適配體-1的序列為：seq?id?no：6，激活劑的序列為：seq?id?no：7，適配體-2的序列為：seq?id?no：8；
13、針對(duì)zen，crrna的序列為：seq?id?no：9，適配體-1的序列為：seq?id?no：10，激活劑的序列為：seq?id?no：11，適配體-2的序列為：seq?id?no：12；
14、針對(duì)fb1，crrna的序列為：seq?id?no：13，適配體-1的序列為：seq?id?no：14，激活劑的序列為：seq?id?no：15，適配體-2的序列為：seq?id?no：16；
15、針對(duì)t-2，crrna的序列為：seq?id?no：17，適配體-1的序列為：seq?id?no：18，激活劑的序列為：seq?id?no：19，適配體-2的序列為：seq?id?no：20；
16、針對(duì)don，crrna的序列為：seq?id?no：21，適配體-1的序列為：seq?id?no：22，激活劑的序列為：seq?id?no：23，適配體-2的序列為：seq?id?no：24。
17、優(yōu)選的，探針兩端分別被淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)連接。
18、優(yōu)選的，探針序列如seq?id?no:26所示。
19、優(yōu)選的，探針連接于量子點(diǎn)的表面；所述的量子點(diǎn)是cdse/zns量子點(diǎn)。
20、優(yōu)選的，所述的探針的制備方法是：
21、s1：稱(chēng)取edc和nhs溶于pb緩沖液中，加入量子點(diǎn)，活化、離心、洗滌、重懸，得到懸濁液；
22、s2：在所述懸濁液中加入ssdna報(bào)告分子，在超聲條件下梯度混合至最終濃度，得到混合液；
23、s3：在所述混合液中加入額外edc，孵育、離心后收集產(chǎn)物，即為qd探針。
24、優(yōu)選的，所述edc和nhs的濃度為1-5mg/ml；所述活化的時(shí)間為10-50min；所述洗滌和重懸的溶液為pbs緩沖液；所述梯度混合的梯度濃度為150-250nm，所述最終濃度為0.5-1.5μm；所述額外edc的濃度為10-30mg/ml；所述孵育的時(shí)間為1-3h。
25、優(yōu)選的，所述的復(fù)合體是由適配體-1、激活劑、適配體-2的摩爾比1-5：1：1-5所構(gòu)成，優(yōu)選2:1:2。
26、優(yōu)選的，所述的復(fù)合體的制備方法是每種真菌毒素的適配體-1、激活劑和適配體-2混合，將混合物加熱，然后自然冷卻至室溫得到。
27、優(yōu)選的，所述的檢測(cè)系統(tǒng)中還本文檔來(lái)自技高網(wǎng)
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【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏馬菌素B1(FB1)、T-2真菌毒素(T-2)或者脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)中的任意一種或幾種組合；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述探針兩端分別被淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)連接；所述探針序列如SEQ?ID?NO:26所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述探針連接于量子點(diǎn)的表面；所述的量子點(diǎn)是CdSe/ZnS量子點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述的探針的制備方法是：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述EDC和NHS的濃度為1-5mg/ml；所述活化的時(shí)間為10-50min；所述洗滌和重懸的溶液為PBS緩沖液；所述梯度混合的梯度濃度為150-250nM，所述最終濃度為0.5-1.5μM；所述額外EDC的濃度為10-30mg/mL；所述孵育的時(shí)間為1-3h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述的復(fù)合體是由適配體-1、激活劑、適配體-2的摩爾比1-5：1：1-5所構(gòu)成，優(yōu)選2:1:2；所述的復(fù)合體的制備方法是每種真菌毒素的適配體-1、激活劑和適配體-2混合，將混合物加熱，然后自然冷卻至室溫得到；所述的檢測(cè)系統(tǒng)中還包括Cas12a酶。
7.一種基于權(quán)利要求1所述的檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)真菌毒素的方法，其特征在于，包括如下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)真菌毒素的方法，其特征在于，步驟1中，復(fù)合物的溶液的濃度是4-20nM，crRNA溶液的濃度是0.5-5μM，探針溶液的濃度是0.5-5μM，Cas12a酶的溶液的濃度是1-20μM；各個(gè)溶液的體積比依次是1.5:0.5-5:0.5-5:0.5-4。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)真菌毒素的方法，其特征在于，所述的步驟2中，熒光強(qiáng)度還通過(guò)聚苯乙烯(PS)微球進(jìn)行信號(hào)放大。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)真菌毒素的方法，其特征在于，所述的聚苯乙烯(PS)微球的直徑范圍是250-550nm。
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【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于crispr/cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)黃曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏馬菌素b1(fb1)、t-2真菌毒素(t-2)或者脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)中的任意一種或幾種組合；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述探針兩端分別被淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)連接；所述探針序列如seq?id?no:26所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述探針連接于量子點(diǎn)的表面；所述的量子點(diǎn)是cdse/zns量子點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述的探針的制備方法是：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述edc和nhs的濃度為1-5mg/ml；所述活化的時(shí)間為10-50min；所述洗滌和重懸的溶液為pbs緩沖液；所述梯度混合的梯度濃度為150-250nm，所述最終濃度為0.5-1.5μm；所述額外ed...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：相欣然，陸佳冉，文千予，張樂(lè)妍，鞠晨，姜湘雲(yún)，陶夢(mèng)熒，李婷，王其傳，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：淮陰師范學(xué)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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