【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種血紅蛋白鯊源納米抗體及其制備方法和應用。
技術介紹
1、血紅蛋白(hemoglobin，hb)是血液中的一種含鐵金屬蛋白，用于運輸含氧血紅細胞，在生物體新陳代謝過程中起著非常重要的作用。血紅蛋白是人血清中含量最豐富的蛋白質，其水平對人體健康狀況十分重要，人血清中hb含量異常可導致某些健康問題，如貧血和紅細胞增多癥等。血紅蛋白對疾病的診斷有著十分重要的意義。抗人血紅蛋白抗體能特異性地結合人血紅蛋白，而不與其他蛋白，如肌紅蛋白、動物血紅蛋白起反應，不會受到各種因素的干擾而導致假陰性及假陽性。此外，該法不需要特殊儀器，操作簡便、反應迅速，具有較高的臨床應用價值。
2、傳統單抗為了保障生產中正確的結構折疊和糖基化等翻譯后修飾，較多采用哺乳動物細胞株進行生產。此外，傳統抗體fab片段及單鏈抗體scfv的抗原結合表面常形成凹形拓撲結構，通常只能識別位于抗原表面的位點，制約其廣泛使用和療效的發揮。使用傳統的抗體檢測hb，可能會受到hb變異體的影響。比如，像hb的一些常見變異體hbf和hbs都有使hb測定結果出現誤差的可能性，存在特異度不高或無法精確定量的問題。
3、20世紀90年代，比利時布魯塞爾自由大學的hamers?casterman和muyldermans發現，在駱駝科動物，如單峰駝、雙峰駝、美洲駝等的血清中，存在著一種天然缺失了輕鏈部分，只含有重鏈部分的重鏈抗體。隨后，在軟骨魚類如鯊魚體內，也檢測到重鏈抗體的存在，其抗體可變區僅由1個重鏈可變區組成，該區域被稱為單域抗體(sdab
技術實現思路
1、為了解決
技術介紹
中存在的問題，本專利技術的目的在于提供一種血紅蛋白鯊源納米抗體及其制備方法和應用。本專利技術提供了能夠以高親和力結合血紅蛋白的鯊源重鏈抗體可變區序列(vnar)，該可變區序列又稱為納米抗體，其能夠用于血紅蛋白的親和純化、免疫學檢測、細胞成像、疾病診斷制藥等領域。
2、本專利技術所采用的技術方案如下：
3、一、一種血紅蛋白鯊源納米抗體：
4、所述鯊源納米抗體的核苷酸序列為seq?id?no.1、seq?id?no.2或seq?id?no.3；所述鯊源納米抗體的氨基酸序列為seq?id?no.4、seq?id?no.5或seq?id?no.6。
5、二、一種血紅蛋白鯊源納米抗體的應用：
6、所述鯊源納米抗體在血紅蛋白的親和純化、免疫學檢測、細胞成像、疾病診斷等領域的應用。
7、鯊源納米抗體在血紅蛋白的親和純化中的應用具體是指利用鯊源納米抗體從血液或組織樣品中富集并純化出血紅蛋白。
8、所述鯊源納米抗體在疾病診斷領域的應用包括鯊源納米抗體在制備診斷紅細胞增多癥/貧血癥藥物中的應用。
9、所述免疫學檢測包括血紅蛋白的酶聯免疫分析、化學發光免疫分析、熒光免疫分析、膠體金免疫分析和免疫傳感分析。
10、所述細胞成像包括免疫熒光成像和體內定位成像。
11、三、一種血紅蛋白鯊源納米抗體的制備方法，包括以下步驟：
12、s1：制備血紅蛋白溶液；
13、s2：對條紋斑竹鯊進行免疫；
14、s3：構建噬菌體抗體文庫；
15、s4：篩選特異性納米抗體；
16、s5：納米抗體重組表達：將抗體序列構建到原核或真核表達載體中，誘導表達重組蛋白，以親和層析柱純化抗體。
17、所述s1中具體為：首先從人血細胞中分離純化得到血紅蛋白抗原，再將血紅蛋白抗原溶于特定溶劑/水中，得到血紅蛋白溶液。
18、所述s2具體為：將血紅蛋白溶液與弗氏完全佐劑以體積比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入條紋斑竹鯊側鰭，并將此次皮下注射作為一次免疫；對條紋斑竹鯊共進行四次免疫，每次均采用皮下注射方式；皮下注射之間相間隔時間為20天，單次免疫劑量為每只條紋斑竹鯊100μg。
19、具體地，首先將s1制得的血紅蛋白溶液與弗氏完全佐劑以體積比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入條紋斑竹鯊側鰭，此為第一次免疫；接著，每間隔20天對條紋斑竹鯊進行加強免疫，每次加強免疫是指將血紅蛋白溶液與弗氏不完全佐劑以體積比1:1混合，待乳化完全后，皮下注射入條紋斑竹鯊側鰭。重復4次，即可完成對條紋斑竹鯊的免疫。
20、所述s3具體為：
21、s31、在末次免疫結束后10天，利用質量分數為0.1％的麻醉劑ms-222噴灑條紋斑竹鯊的口鼻和鰓，使條紋斑竹鯊麻醉，再經尾靜脈采集條紋斑竹鯊的外周血，對外周血進行離心收集淋巴細胞溶液，再從淋巴細胞溶液中提取總rna并反轉錄為cdna；
22、s32、以cdna為模板，利用高保真酶擴增獲得vnar片段；
23、s33、以pr2噬菌粒為模板，用高保真酶擴增pr2噬菌粒，利用內切酶酶切pr2噬菌粒模板；所述內切酶具體為dpn?i；
24、s34、將vnar片段與酶切之后的pr2噬菌粒通過無縫克隆連接，電轉化感受態細菌，稀釋涂布細菌，將細菌刮板凍存，得到噬菌體抗體文庫。
25、具體實施中，可計數噬菌體抗體文庫的文庫大小，若文庫大小小于預設的閾值，則舍棄該噬菌體抗體文庫病并重復s3以重新處理制備抗體文庫。
26、所述s4具體為：
27、s41、活化噬菌體抗體文庫的菌株，并加入輔助噬菌體，經靜置培養和離心收集菌體后，將菌體震蕩培養過夜；
28、s42、利用peg沉淀法富集噬菌體，計算富集的噬菌體的滴度；
29、s43、包被0.1mg/ml血紅蛋白溶液于96孔免疫板的孔中，并將包被有蛋白的孔作為血紅蛋白組，將未包被蛋白的孔作為陰性對照組，上述兩組孔中均加入富集的噬菌體，使噬菌體與免疫板上的蛋白結合，經多次洗滌，用胰酶洗脫得到特異性結合血紅蛋白的噬菌體；
30、具體是將血紅蛋白溶液與陰性對照包被于免疫板的孔中，再將富集的噬菌體加入到血紅蛋白溶液實驗組與陰性對照組中。
31、s44、將特異性結合血紅蛋白的噬菌體侵染tg1細菌，稀釋涂布平板，培養獲得單菌落，并計數血紅蛋白組與陰性對照組的菌落數量，并使得血紅蛋白組菌落大于陰性對照組菌落的數量；
32、s45、挑取血紅蛋白組單菌落于96孔免疫板中，加入輔助噬菌體，擴增得到單克隆噬菌體；
33、s46、再次包被1μg/ml血紅蛋白溶液于本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種血紅蛋白鯊源納米抗體，其特征在于：
2.如權利要求1所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
4.根據權利要求2所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
5.根據權利要求2所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
6.如權利要求1-5任一所述血紅蛋白鯊源納米抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.根據權利要求6所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的制備方法，其特征在于：
8.根據權利要求6所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的制備方法，其特征在于：
9.根據權利要求6所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的制備方法，其特征在于：
10.根據權利要求8所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的制備方法，其特征在于：所述S34中無縫克隆連接具體為：
【技術特征摘要】
1.一種血紅蛋白鯊源納米抗體，其特征在于：
2.如權利要求1所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
4.根據權利要求2所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
5.根據權利要求2所述的血紅蛋白鯊源納米抗體的應用，其特征在于：
6.如權利要求1-5任一所述血紅蛋白鯊源納...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳玉磊，鐘寧，雷雯惠，曹敏杰，張凌晶，孫樂常，
申請(專利權)人：集美大學，
類型：發明
國別省市：
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