【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于獸用生物制品，具體是設計并合成1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv1)orf2-6基因的共有序列，構建并成功拯救獲得含有該orf2-6共有序列、具有marc-145細胞嗜性、可激活tfh細胞、能誘導交叉中和抗體和提供交叉保護的嵌合病毒。
技術介紹
1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)是嚴重危害我國養豬業發展的重要病原。prrsv可分為prrsv1和prrsv2兩個種(species)，其中prrsv2在我國的流行毒株中占主導地位。但是，近年來幾乎所有省份都有prrsv1檢出的報道，且毒株之間基因組同源性較低，已形成多個獨立的演化分支，并在部分地區引發疫病造成極大經濟損失。prrsv是目前已知變異最快的rna病毒之一，不同毒株感染誘導的免疫應答缺乏交叉保護。而現有商品化疫苗均基于prrsv2毒株研制，無法為我國prrsv1流行株感染提供足夠的交叉保護。此外，我國prrsv1流行株無法適應體外傳代培養，這也阻礙了我國prrsv1疫苗的研制進程。
2、prrsv是一種單股正鏈rna病毒，其基因組大小約為15kb，包含至少10個開放閱讀框(orf)。其中，orf2-6編碼7個結構蛋白(gp2a,gp2b,gp3,gp4,gp5a,gp5和m)，包含能夠誘導中和抗體的多個抗原表位。但是誘導prrsv1交叉中和抗體的策略與機制尚不明確。濾泡輔助性t細胞(tfh)是一種專職輔助b細胞分化、成熟并誘導抗體產生的cd4+t細胞亞群。前人研究表明，tfh細胞活化與sars-cov-2等病毒誘導交叉中和抗體密切相關。但
3、反向遺傳操作技術是研制新型基因工程疫苗的重要手段。通過反向遺傳操作制備含prrsv1囊膜蛋白編碼基因(orf2-6)的嵌合病毒，可誘導豬體產生更為廣譜的交叉免疫應答進而抵御異源毒株感染。為應對我國日趨復雜的prrsv1流行所引發的疫情，亟需研制基于我國prrsv1流行毒株、可在體外傳代細胞培養、可誘導交叉保護的新型基因工程疫苗。但相關研究目前未有報道。
技術實現思路
1、針對目前我國缺乏可適應傳代marc-145細胞，且可誘導交叉保護的prrsv1商品化疫苗問題，本專利技術提供一株以我國prrsv1流行毒株為骨架的包含合成的prrsv1?orf2-6基因共有序列的嵌合病毒。通過基因設計改造，該嵌合病毒獲得在體外傳代marc-145細胞上增殖的能力，且接種豬體可激活tfh細胞、誘導更高的交叉中和抗體滴度，提供抗異源prrsv1毒株的交叉保護，為研制我國首個prrsv1基因工程疫苗提供了疫苗候選株。
2、本專利技術是通過以下技術方案實現的：
3、在本專利技術的一個方面，提供了prrsv1?orf2-6共有序列及其設計方法。具體包括通過比對genebank上獲得的10株中國prrsv1代表分離株orf2-6基因序列，設計合成與不同prrsv1毒株orf2-6基因同源性普遍提高的orf2-6共有序列。該orf2-6共有序列與我國四類prrsv1分離代表株(amervac、bjeu06-1、hkeu16和nmeu09-1株)orf2-6基因同源性均高于90％。orf2-6共有序列用于制備可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、在本專利技術的另一個方面，提供一種重組質粒pacyc177-cmv-rhljb1-orf2-6-con，所述重組質粒包含orf2-6共有序列的dna信息。重組質粒用于制備可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con。
5、在本專利技術的另一方面，提供了可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con，該嵌合病毒orf2-6-con由重組質粒pacyc177-cmv-rhljb1-orf2-6-con拯救制備，orf2-6-con嵌合病毒核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
6、在本專利技術的另一方面，提供了可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con的制備方法，首先合成orf2-6共有序列基因片段，隨后利用酶切連接方法，將合成的orf2-6共有序列替換rhljb1中相應片段，成功構建并拯救含有orf2-6共有序列的可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con。
7、進一步地，所述的方法包括如下步驟：
8、1)設計合成orf2-6共有序列；
9、2)puc57-synthesis-prrsv1-orf2-6-con質粒合成；
10、3)引物設計；
11、4)pacyc177-cmv-rhljb1-orf2-6-con感染性克隆重組質粒構建；
12、5)orf2-6-con嵌合病毒拯救。
13、進一步地，步驟3)中設計的引物如下：
14、
15、
16、在本專利技術的另一方面，提供可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con在制備prrsv1基因工程疫苗候選株中的應用，提供了能適應體外培養的，包含合成的orf2-6共有序列的prrsv1基因工程疫苗候選株。不同于親本毒株，該嵌合病毒獲得了marc-145細胞嗜性，可在體外傳代細胞中大量增殖，有利于疫苗大批量生產。
17、將上述構建拯救的嵌合病毒體外連續傳代后應用于接種豬體。以其親本病毒作為對照，兩者均可誘導豬體產生同源中和抗體，但僅有含orf2-6共有序列的嵌合病毒可激活tfh細胞、誘導更高水平的交叉中和抗體、并為豬體提供更好的交叉保護。該嵌合病毒可作為疫苗候選株，用于培育我國首個prrsv1基因工程疫苗。
18、本專利技術具有以下有益效果：1、以我國prrsv1弱毒株感染性克隆病毒為親本，構建含有合成的orf2-6共有序列的prrsv1嵌合毒株；2、所構建的嵌合病毒有良好的體內外增殖效力，接種marc-145傳代細胞均可引起細胞病變(cpe)，接種豬體可以出現特異性病毒血癥；3、所構建的嵌合病毒均具有良好的安全性，接種豬體后不產生臨床癥狀、不引起發熱(體溫<40℃)，不影響增重，更不會引起仔豬死亡；4、所構建的嵌合病毒可以顯著性激活tfh細胞并誘導更高水平的交叉中和抗體，進而提供比其親本毒株更好的交叉保護。
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1.一種ORF2-6共有序列，用于制備可激活Tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒ORF2-6-CON，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.一種重組質粒pACYC177-CMV-rHLJB1-ORF2-6-CON，其特征在于，所述重組質粒包含權利要求1所述的ORF2-6共有序列，所述重組質粒用于制備可激活Tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒ORF2-6-CON。
3.可激活Tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒ORF2-6-CON，其特征在于，所述ORF2-6-CON嵌合病毒由權利要求2所述的重組質粒pACYC177-CMV-rHLJB1-ORF2-6-CON拯救制備，ORF2-6-CON嵌合病毒核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
4.權利要求3所述的可激活Tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒ORF2-6-CON的構建方法，其特征在于，所述方法如下：
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：p>
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟3)中設計的引物如下：
7.可激活Tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒ORF2-6-CON在制備PRRSV1基因工程疫苗候選株中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種orf2-6共有序列，用于制備可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種重組質粒pacyc177-cmv-rhljb1-orf2-6-con，其特征在于，所述重組質粒包含權利要求1所述的orf2-6共有序列，所述重組質粒用于制備可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con。
3.可激活tfh細胞并誘導交叉中和抗體的1型豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒orf2-6-con，其特征在于，所述orf2-6-con嵌合病毒由權利要求2所述的重組質粒pa...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳南華，李樹濱，邱明，林鴻，朱建中，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：
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