【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于表面等離子共振分析測(cè)試，具體來(lái)說(shuō)涉及一種基于表面等離子共振技術(shù)分析藥物在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)的方法。
技術(shù)介紹
1、眾所周知，藥物進(jìn)入血液后會(huì)不同程度與血漿中的蛋白結(jié)合，如白蛋白、糖蛋白等。由于這種結(jié)合是可逆的，藥物分子會(huì)在此過(guò)程中建立一個(gè)結(jié)合態(tài)-游離態(tài)的平衡。一方面，藥物與血漿蛋白的結(jié)合會(huì)降低血藥濃度，另一方面，血漿蛋白也是藥物的載體，有利于提高藥物的溶解度(j.ghuman,p.a.zunszain,i.petitpas,et?al.j.mol.biol.,2005,353,38)。藥物與載體蛋白之間的親和力強(qiáng)弱非常重要，一方面，藥物需要與載體有足夠強(qiáng)的作用來(lái)促進(jìn)藥物的運(yùn)輸及分布；另一方面，藥物與載體蛋白的結(jié)合不宜過(guò)強(qiáng)，以免影響藥物在靶標(biāo)的釋放。因此，研究藥物與載體蛋白之間的相互作用是十分有意義的，可以提高對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)的認(rèn)識(shí)(p.j.hajduk,r.mendoza,a.m.petros,et?al.journal?of?computer-aided?molecular?design,2003,17,93)。
2、有研究表明，多數(shù)藥物通過(guò)兩個(gè)主要的結(jié)合位點(diǎn)(sudlow位點(diǎn)i和sudlow位點(diǎn)ii)與牛血清白蛋白(bsa)結(jié)合(a.bujacz,k.zielinski,b.sekula.proteins,2014,82,2199)。常見(jiàn)藥物與bsa的親和力數(shù)值已有廣泛報(bào)道，但是，對(duì)于確定藥物在bsa上的具體結(jié)合位點(diǎn)(sudlow位點(diǎn)i或sudlow位點(diǎn)ii)的報(bào)道較少，且不同藥物分子結(jié)合位點(diǎn)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種基于表面等離子共振技術(shù)分析藥物在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)的方法，該方法采用表面等離子共振(spr)技術(shù)，可同時(shí)獲得藥物血清白蛋白親和力數(shù)值及確定藥物在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)。
2、本專利技術(shù)的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。
3、一種基于表面等離子共振技術(shù)分析藥物在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)的方法，包括以下步驟：
4、步驟1，采用直接耦連的方式將血清白蛋白固定于生物芯片上；
5、在步驟1中，所述直接耦連的方式為氨基耦連或巰基耦連。
6、在上述技術(shù)方案中，所述血清白蛋白的偶聯(lián)量為6000～16000ru。
7、步驟2，準(zhǔn)備兩種類型的第一溶液，第一溶液為溶劑和藥物小分子的混合物，一種類型的第一溶液的藥物小分子能夠與血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)i結(jié)合，另一種類型的第一溶液的藥物小分子能夠與血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)ii結(jié)合，能夠與血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)i結(jié)合的藥物小分子為位點(diǎn)標(biāo)記物i，能夠與血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)ii結(jié)合的藥物小分子為位點(diǎn)標(biāo)記物ii；
8、每種類型的第一溶液均準(zhǔn)備多份，每種類型的多份第一溶液中藥物小分子濃度遞增，將兩種類型的第一溶液按照藥物小分子濃度遞增的順序依次上機(jī)流過(guò)所述生物芯片，通過(guò)表面等離子共振(spr)技術(shù)采集實(shí)時(shí)信號(hào)，得到spr數(shù)據(jù)，進(jìn)而得到位點(diǎn)標(biāo)記物i與血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)i結(jié)合的親和力kd(i)和位點(diǎn)標(biāo)記物ii與血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)ii結(jié)合的親和力kd(ii)；
9、步驟3，準(zhǔn)備多份第二溶液：將待測(cè)藥物溶解在第二混合物中，所述第二混合物為溶劑和位點(diǎn)標(biāo)記物i的混合物，第二混合物中位點(diǎn)標(biāo)記物i的濃度為2～5kd(i)；準(zhǔn)備多份第三溶液：將待測(cè)藥物溶解在第三混合物中，所述第三混合物為溶劑和位點(diǎn)標(biāo)記物ii的混合物，第三混合物中位點(diǎn)標(biāo)記物ii的濃度為2～5kd(ii)；
10、多份第二溶液中待測(cè)藥物濃度遞增，多份第三溶液中待測(cè)藥物濃度遞增；
11、將多份第二溶液和多份第三溶液分別按照待測(cè)藥物濃度遞增的順序依次上機(jī)流過(guò)所述生物芯片，通過(guò)表面等離子共振(spr)技術(shù)采集實(shí)時(shí)信號(hào)，得到spr數(shù)據(jù)，進(jìn)而得到待測(cè)藥物和血清白蛋白在位點(diǎn)標(biāo)記物i存在下的競(jìng)爭(zhēng)親和力值kd(x+i)和待測(cè)藥物和血清白蛋白在位點(diǎn)標(biāo)記物ii存在下的競(jìng)爭(zhēng)親和力值kd(x+ii)；
12、步驟4，比較kd(x)分別與kd(x+i)和kd(x+ii)的關(guān)系：
13、如果kd(x+i)顯著大于kd(x)且kd(x+ii)與kd(x)無(wú)顯著差異，待測(cè)藥物結(jié)合于血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)i；
14、如果kd(x+ii)顯著大于kd(x)且kd(x+i)與kd(x)無(wú)顯著差異，則待測(cè)藥物結(jié)合于血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)ii；
15、如果kd(x+ii)、kd(x+i)均與kd(x)無(wú)顯著差異，則待測(cè)藥物與血清白蛋白的sudlow位點(diǎn)i和sudlow位點(diǎn)ii均有相互作用；
16、計(jì)算其中，kdmax為競(jìng)爭(zhēng)親和力值(競(jìng)爭(zhēng)親和力值為kd(x+ii)或kd(x+i))和kd(x)中較大的值，kdmin為競(jìng)爭(zhēng)親和力值(競(jìng)爭(zhēng)親和力值為kd(x+ii)或kd(x+i))和kd(x)中較小的值，當(dāng)時(shí)，kdmax和kdmin為無(wú)顯著差異，當(dāng)時(shí)，kdmax顯著大于kdmin；
17、其中，獲得kd(x)的方法為：準(zhǔn)備多份第四溶液，第四溶液為溶劑和待測(cè)藥物的混合物，多份第四溶液中待測(cè)藥物濃度遞增，第四溶液按照待測(cè)藥物濃度遞增的順序依次上機(jī)流過(guò)所述生物芯片，通過(guò)表面等離子共振(spr)技術(shù)采集實(shí)時(shí)信號(hào)，得到spr數(shù)據(jù)，得到待測(cè)藥物與血清白蛋白的親和力kd(x)。
18、在上述技術(shù)方案中，溶劑為dmso和pbsp的混合物，按體積分?jǐn)?shù)計(jì)，溶劑中dmso為2～5％。
19、在上述技術(shù)方案中，每種類型的多份第一溶液中藥物小分子濃度為3.9～500μm，多份第二溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μm；多份第三溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μm，多份第四溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μm。
20、在上述技術(shù)方案中，所述親和力值的單位為μm。
21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果在于：
22、在分子相互作用的研究中，首先需要確定的是分子間相互作用強(qiáng)弱，即分子間的親和力；其次是分子與分子相互作用所發(fā)生的位置，即結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)問(wèn)題依次遞進(jìn)地闡釋了分子間地相互作用機(jī)制。本專利技術(shù)基于表面等離子共振分析技術(shù)，采用本專利技術(shù)的方法，僅通過(guò)四次測(cè)試可同時(shí)獲得待測(cè)藥物與血清白蛋白的親和力值以及待測(cè)藥物在血清白蛋白的具體結(jié)合位點(diǎn)。
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1.一種基于表面等離子共振技術(shù)分析藥物在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每種類型的多份第一溶液中藥物小分子濃度為3.9～500μM，多份第二溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μM；多份第三溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μM，多份第四溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1中，所述直接耦連的方式為氨基耦連或巰基耦連。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清白蛋白的偶聯(lián)量為6000～16000RU。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，溶劑為DMSO和PBSP的混合物，按體積分?jǐn)?shù)計(jì)，溶劑中DMSO為2～5％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述親和力值的單位為μM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每種類型的第一溶液均準(zhǔn)備多份，每種類型的多份第一溶液中藥物小分子濃度遞增，多份第二溶液中待測(cè)藥物濃度遞增，多份第三溶液中待測(cè)藥物濃度遞增，多份第四溶液中待測(cè)
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于表面等離子共振技術(shù)分析藥物在血清白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每種類型的多份第一溶液中藥物小分子濃度為3.9～500μm，多份第二溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μm；多份第三溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μm，多份第四溶液中待測(cè)藥物濃度為3.9～500μm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1中，所述直接耦連的方式為氨基耦連或巰基耦連。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郭爽，管祥辰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南開大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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