【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，特別涉及一種多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法及其應用。
技術介紹
1、禽多殺性巴氏桿菌為卵圓或短桿狀的革蘭氏陰性菌，其所引起的敗血性傳染病，以發熱、腹瀉、呼吸困難為特征，最急性病例迅速死亡，禽感染后表現為急性敗血過程，因而又被稱為禽霍亂。禽霍亂是一種接觸性傳染病，危害多種家禽、野禽。其特征表現為急性敗血過程，發病率和死亡率都很高。低毒感染或急性發病之后，可出現慢性的、局部性的疾病。這是一種尚無很好防治方法而又造成重大經濟損失的禽類疾病，在臨床上，常用抗生素和疫苗來預防和治療多殺性巴氏桿菌引起的疾病。然而，在禁抗政策下，目前市面上用于預防該病的疫苗仍然以傳統的弱毒活疫苗和滅活疫苗為主，但禽多殺性巴氏桿菌抗原結構較為復雜，且易發生變異，導致目前商品化弱毒疫苗的免疫效果并不是特別理想。弱毒活苗還存在免疫期較短、免疫保護力偏低、局部及全身的反應偏大，可能存在散毒危險、殘余毒力引起蛋雞產蛋率下降等問題，而禽霍亂滅活疫苗的保護效果尚不及弱毒活疫苗，應用較少。在禁抗及獸用細菌疫苗存在不同血清型間交叉保護性差兩大難關下，開發有效的巴氏桿菌疫苗有重要的現實意義。
2、關于防控禽多殺性巴氏桿菌病的基因工程疫苗，目前有多種經典遺傳操作系統可選擇用于構建禽多殺性巴氏桿菌基因缺失突變株，如抗生素自殺系統，sacb選擇系統，溫敏自殺系統，galk選擇系統，ngago/gdna系統，crispr?cas9基因編輯系統，但均敲除效率低或無法敲除。多殺性巴氏桿菌缺乏高效、簡便的遺傳操作工具是個開發基因工程疫苗的重大難
3、phes基因是苯丙氨酰-trna合成酶a亞基編碼基因，該基因的一個點突變基因(gcg→ggg)編碼的phes突變蛋白質(ala→gly)能夠氨?；交彼犷愃莆铮缢?氯-苯丙氨酸(4-c1-phe)，這些氨酰化的苯基丙氨酸類似物會插入細胞蛋白而對宿主菌有毒性致死作用。但到目前為止，采用phes點突變基因為反向篩選基因在禽多殺性巴氏桿菌中進行基因插入的技術以及整合體系構建的方法國內外未見有相關報道。
技術實現思路
1、本專利技術的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法。
2、本專利技術的另一目的在于提供所述方法構建得到的多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株。
3、本專利技術的再一目的在于所述多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的應用。
4、本專利技術的目的通過下述技術方案實現：
5、一種多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，包括如下步驟：
6、s1、將如seq?id?no.1所示的含卡那霉素抗性基因kan和大腸桿菌cole1復制子的dna序列作為載體，然后通過同源重組酶與seq?id?no.2所示的含有phesm點突變基因與溫敏復制子的dna序列(pcr產物)無縫連接，得到連接產物；再將連接產物轉入大腸桿菌，經鑒定篩選、抽提質粒，獲得溫度敏感載體phyf01；
7、s2、將步驟s1中得到的溫度敏感載體phyf01線性化后與上下同源片段無縫連接，得到hptc基因插入突變重組質粒phyf02；其中，上下同源片段的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；
8、s3、將步驟s2中得到的hptc基因插入突變重組質粒phyf02轉化至禽多殺性巴氏桿菌感受態，并利用卡那霉素抗性篩選陽性轉化子，經鑒定得到hptc重組菌株(具有卡那霉素抗性和四氯苯丙氨酸敏感性)；
9、s4、將步驟s3中得到的hptc重組菌株在42℃條件下、含卡那霉素的培養基中培養使重組質粒phyf02與禽多殺性巴氏桿菌的基因組發生第一次同源重組，得到單交換菌株(具有卡那霉素抗性和四氯苯丙氨酸敏感性)；
10、s5、將步驟s4中得到的單交換菌株經四氯苯丙氨酸抗性篩選，得到發生第二次同源重組的雙交換菌株(hptc缺失突變菌株，不具有卡那霉素抗性和四氯苯丙氨酸敏感性)，即所述多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株。
11、步驟s1中所述的phesm點突變基因為phes基因第294位ala突變為gly的點突變基因(gcg294ggg)，其基因序列如seq?id?no.4所示，編碼蛋白序列如seq?id?no.5所示。
12、步驟s1中所述的大腸桿菌優選為大腸桿菌dh5α。
13、步驟s1中所述的鑒定優選為采用pcr的方法進行鑒定，其pcr引物序列如下：
14、f3:5’-cagcattccaggtattagaag-3’；
15、r3:5’-gcatccaatgcttgttcg-3’。
16、步驟s2中所述的溫度敏感載體phyf01線性化為采用特異性引物將溫度敏感載體phyf01線性化，其特異性引物如下：
17、f6：5’-gatccactagttctagagcgg-3’；
18、r6：5’-gcaggaattcgatatcaagc-3’。
19、步驟s2，選取的目的基因hptc插入位點(突變位點)可以是多殺性巴氏桿菌基因組中的任何位點。
20、步驟s3中所述的轉化為采用常規電擊轉化的方式進行。
21、步驟s3中所述的禽多殺性巴氏桿菌優選為多殺性巴氏桿菌cvcc44801株(簡稱c48-1株)。
22、步驟s3中所述的卡那霉素的用量為按其在體系終濃度為30ug/ml添加計算。
23、步驟s3中所述的鑒定優選為采用pcr的方法進行鑒定，其pcr引物序列如下：
24、f4：5’-ccgctctagaactagtggatcaagagcacaactaaaagcag-3’；
25、r5：5’-gcttgatatcgaattcctgctaaggcatcgtttgtgcgtg-3’。
26、步驟s4中所述的卡那霉素的用量為按其在體系終濃度為50ug/ml添加計算。
27、步驟s4中所述的單交換菌株優選為依次采用卡那霉素和慶大霉素進行篩選。
28、所述的慶大霉素的用量為按其在體系終濃度為30ug/ml添加計算。
29、步驟s4中所述的單交換菌株優選為通過如下方法實現：將hptc重組菌株接種到含有50ug/ml卡那霉素的tsb液體培養基中，于180±20rpm/min、42℃(含有溫度敏感復制子的質粒在42℃高溫傳代質粒會丟失)條件下培養16小時以上，然后將獲得的菌液涂布到含有30ug/ml慶大霉素的tsa平板上，于37℃條件下培養24小時以上，經鑒定獲得單交換菌株。
30、所述的tsb液體培養基的配制方法如下：1l去離子水中加入胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，nacl?5g，調節ph為中性，121℃高溫蒸汽滅菌。
31、所述的tsa培養基的配制方法如下：1l去離子水中加入胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，nacl?5g，瓊脂15g，調節ph為中本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
3.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
4.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
5.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
6.根據權利要求5所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
7.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
8.一種多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株，其特征在于：通過權利要求1～7任一項所述的方法制備得到。
9.權利要求8所述的多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株在制備禽多殺性巴氏桿菌疫苗中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于：所述的禽為家禽。
【技術特征摘要】
1.一種多殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
3.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
4.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
5.根據權利要求1所述的殺性巴氏桿菌無抗性標記基因整合菌株的構建方法，其特征在于：
【專利技術屬性】
技術研發人員：江金飛，馮賽祥，趙一珊，孫娟，周夢若，陳愛華，梁銘治，謝倩梅，代繪琳，張廣文，周紫晴，王浠婕，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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