【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及疫苗，具體涉及編碼正痘病毒屬病毒蛋白或其同源蛋白的mrna的組合物疫苗及其制備方法和在預(yù)防痘病毒感染方面的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、猴痘是一種由猴痘病毒感染引起的罕見疾病。猴痘病毒與能夠引起天花的天花病毒屬于同一病毒家族。猴痘癥狀與天花癥狀相似，但較輕，而且猴痘很少致命(西非突變株的死亡率為1％，而中非突變株的死亡率為10％左右)。猴痘發(fā)現(xiàn)于1958年，當(dāng)時(shí)在用于研究的猴子群中爆發(fā)了兩次類似痘的疾病。盡管被命名為“猴痘”，但這種疾病的來源仍然未知。1970年，剛果(金)發(fā)現(xiàn)首例人感染猴痘病例。之后，猴痘病毒主要在西非和中非地區(qū)流行，包括剛果(金)、剛果(布)、中非共和國(guó)、尼日利亞、喀麥隆等非洲國(guó)家。非洲大陸之外的首次猴痘疫情于2003年出現(xiàn)在美國(guó)，傳染源可追溯至從加納運(yùn)到美國(guó)的岡比亞鼠和睡鼠。而自2018年以來在以色列、英國(guó)、新加坡等國(guó)發(fā)現(xiàn)的猴痘病毒感染者多為來自尼日利亞的旅客。隨著猴痘疫情在全世界多個(gè)國(guó)家的激增，世衛(wèi)組織也于2022年5月23日宣布猴痘疫情已構(gòu)成國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。截至2023年8月9日，全球共有猴痘病例89,308起，而中國(guó)猴痘病例達(dá)到890起。其中，2023年7月～8月，國(guó)內(nèi)激增524例猴痘病例，呈明顯上升趨勢(shì)。此前有兩種天花疫苗被考慮用于應(yīng)對(duì)猴痘的全球疫情，分別是acam2000和jynneos其中，acam2000是一種競(jìng)爭(zhēng)復(fù)制型的活病毒疫苗，不適用于免疫力低下的人群使用，也容易造成無意接種或自動(dòng)接種；接種后會(huì)出現(xiàn)皮疹和結(jié)痂，而且約0.57％的接種者會(huì)出現(xiàn)心肌心包炎。而另一款疫苗jyn
2、猴痘病毒存在兩種形式：成熟病毒粒子(mature?virions，mv)和細(xì)胞外病毒粒子(extracellular?virions，ev)。mv是在宿主細(xì)胞內(nèi)形成，并通過細(xì)胞裂解釋放到胞外；也有一部分胞內(nèi)mv被轉(zhuǎn)移至高爾基體中包裹上一層額外的包膜，形成ev之后，最終通過胞吐釋放到胞外。ev一般游離在胞外基質(zhì)中，也有小部分附著在細(xì)胞表面。mv被認(rèn)為對(duì)病毒在環(huán)境中宿主之間的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和傳播十分重要；而ev被認(rèn)為對(duì)病毒在生物體內(nèi)細(xì)胞間的傳播發(fā)揮作用。由于ev比mv多了一層外包膜，兩者進(jìn)入細(xì)胞的過程也有一定的差異。當(dāng)mv入侵宿主細(xì)胞時(shí)，首先通過其膜表面的錨定蛋白與細(xì)胞結(jié)合，然后由進(jìn)入融合復(fù)合體(entry?fusioncomplex，efc)介導(dǎo)或胞飲作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。然而ev在進(jìn)入細(xì)胞之前，其外層的包膜首先發(fā)生配體誘導(dǎo)的非融合反應(yīng)而被破裂[3]，然后內(nèi)膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，過程與mv類似。
3、猴痘病毒的基因組大小約為197kb，編碼190多種蛋白質(zhì)。猴痘病毒蛋白與牛痘病毒蛋白同一性很高，功能也很保守。比如，牛痘病毒蛋白a27l、a33r、l1r、b5r分別與猴痘病毒蛋白a29l、a35r、m1r、b6r同源。病毒表面的蛋白在其入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要的作用。其中，h3、a27、d8參與mv與細(xì)胞的結(jié)合[5]；蛋白a16、a21、a28、g3、g9、h2、j5、l5、f9、l1、o3、i2共同組成融合復(fù)合體efc，參與ev和mv與細(xì)胞的融合[2,3,6]；而l1、h3同時(shí)也參與mv在細(xì)胞內(nèi)的成熟過程[7]。而b5和a33是ev外包膜所特有的蛋白，其中,，b5參與了ev的形成和外包膜的破裂[3,8,9]，而a33與病毒在細(xì)胞間的傳播有關(guān)[10]。另外，a27也參與了胞內(nèi)mv的轉(zhuǎn)移[11]。疫苗是遏制傳染病流行的流行的關(guān)鍵手段之一。jynneos被認(rèn)為是現(xiàn)階段最好的天花或猴痘疫苗，也已經(jīng)在美國(guó)、加拿大、歐盟獲批用于預(yù)防猴痘病毒。雖然作為非復(fù)制型的減毒活疫苗副作用相對(duì)較小，但具有接種傳染的風(fēng)險(xiǎn)，并且未采用猴痘特異有效抗原。因此，仍需通過其他技術(shù)開發(fā)更為有效和安全的疫苗。隨著mrna疫苗在新冠病毒預(yù)防中成功應(yīng)用，突顯mrna疫苗的有效性和安全性。另外，mrna疫苗具有研發(fā)周期短、產(chǎn)能增速快等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，同樣適合猴痘病毒的預(yù)防性疫苗的應(yīng)急研制與開發(fā)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)術(shù)語“中性脂質(zhì)”術(shù)語是指不帶電荷的、非磷酸甘油酯的脂質(zhì)分子。
2、本專利技術(shù)術(shù)語“聚乙二醇(peg)-脂質(zhì)”是指包含脂質(zhì)部分和聚乙二醇部分的分子。
3、本專利技術(shù)術(shù)語“脂質(zhì)納米顆?！笔侵妇哂兄辽僖粋€(gè)納米量級(jí)尺寸的顆粒，其包含至少一種脂質(zhì)。
4、本專利技術(shù)術(shù)語“疫苗”是指適合于應(yīng)用于動(dòng)物(包括人)的組合物，在施用后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，其強(qiáng)度足以最低限度地幫助預(yù)防、改善或治愈起因于由微生物感染的臨床疾病。
5、本專利技術(shù)術(shù)語，“n/p”為陽離子脂質(zhì)中n與mrna單核苷酸中p的摩爾比。
6、本專利技術(shù)的第一方面，提供了一種mrna組合物，所述組合物包括編碼至少一種抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白選自猴痘病毒h3l蛋白、b6r蛋白、m1r蛋白、a35r蛋白、a29l蛋白、e8l蛋白、a30l蛋白、a5l蛋白、c19l蛋白或其同源蛋白中的一種或者多種，所述同源蛋白與上述蛋白具有至少75％同一性且與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的蛋白或其抗原性片段。
7、優(yōu)選地，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括h3l蛋白或h3l同源蛋白。
8、優(yōu)選地，所述同源蛋白與上述蛋白具有至少75％同一性更優(yōu)選地，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。例如，
9、優(yōu)選地，所述h3l蛋白的序列為seq?id?no:4，h3l同源蛋白序列與seq?id?no:4具有至少75％的同一性，更優(yōu)選地，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。
10、優(yōu)選地，所述組合物還包括：編碼猴痘蛋白m1r或m1r同源蛋白的mrna、編碼猴痘蛋白b6r或b6r同源蛋白的mrna、編碼a35r或a35r同源蛋白的mrna中的一種或多種。
11、優(yōu)選地，所述m1r蛋白的序列為seq?id?no:3，m1r同源蛋白序列與seq?id?no:3具有至少75％的同一性，更優(yōu)選地，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。
12、優(yōu)選地，所述b6r蛋白的序列為seq?id?no:1，b6r同源蛋白序列與seq?id?no:1具有至少75％的同一性；更優(yōu)選地，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。
13、優(yōu)選地，所述a35r蛋白的序列為seq?id?no:2，a35r同源蛋白序列與seq?id?no:2具有至少75％的同一性，更優(yōu)選地，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。
14、優(yōu)選地，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括兩種或者兩種以上的組合，所述兩種或者兩種以上的抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白分別表達(dá)或者融合表達(dá)，
15、更優(yōu)選地本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種mRNA組合物，其特征在于，所述組合物包括編碼至少一種抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白選自猴痘病毒H3L蛋白、B6R蛋白、M1R蛋白、A35R蛋白、A29L蛋白、E8L蛋白、A30L蛋白、A5L蛋白、C19L蛋白或其同源蛋白中的一種或者多種，所述同源蛋白與上述蛋白具有至少75％同一性且與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的蛋白或其抗原性片段，優(yōu)選地，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括H3L蛋白或其同源蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mRNA組合物，其特征在于，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括兩種或者兩種以上的組合，所述兩種或者兩種以上的抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白分別表達(dá)或者融合表達(dá)，優(yōu)選地，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白分別表達(dá)，所述組合物包括多個(gè)mRNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的mRNA組合物，其特征在于，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括如下表所示的組合：
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的mRNA組合物，其特征在于，所述mRNA序列是天然或修飾的RNA，所述修飾的RNA包括通過用修飾的尿苷部分或全部取代天然尿苷對(duì)RNA進(jìn)行修飾；優(yōu)選地，所述mRNA序列是
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的mRNA組合物，其特征在于，所述mRNA除包含上述編碼區(qū)外還包括5’帽子結(jié)構(gòu)，5’非編碼區(qū)，3’非編碼區(qū)和/或多聚腺苷酸尾的mRNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的mRNA組合物，其特征在于，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白的修飾還包括在N端或C端增加用于形成多聚體的片段，所述片段包括Fc片段或噬菌體T4纖維蛋白的三聚化基序。
7.一種正痘病毒屬mRNA疫苗，其特征在于，由遞送載體包裹的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的組合物；優(yōu)選地，所述遞送載體為脂質(zhì)納米顆粒(LNP)，所述mRNA包封于所述脂質(zhì)納米顆粒(LNP)中，優(yōu)選地，所述組合物包括多個(gè)mRNA，所述遞送載體分別包裹單個(gè)mRNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的正痘病毒屬mRNA疫苗，其特征在于，所述脂質(zhì)納米顆粒包含陽離子脂質(zhì)、中性磷脂、甾族脂質(zhì)和聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)所述的正痘病毒屬mRNA疫苗，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)：中性磷脂：甾族脂質(zhì)：PEG-脂質(zhì)摩爾比為30-60:1-20:20-50:0.1-10。
10.一種正痘病毒屬mRNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括將陽離子脂質(zhì)、中性磷脂、甾族脂質(zhì)、聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)溶解至溶劑后對(duì)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述mRNA組合物進(jìn)行包封，優(yōu)選地，所述原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括兩種或者兩種以上的組合，所述兩種或者兩種以上的抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白分別表達(dá)或者融合表達(dá)，制得多價(jià)疫苗。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，包封完成后，使用Tris緩沖液、乙酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液對(duì)包裝樣品進(jìn)行稀釋。
12.一種權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的mRNA組合物或權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的mRNA疫苗在制備用于預(yù)防或者治療正痘病毒感染的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述正痘病毒為猴痘病毒。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種mrna組合物，其特征在于，所述組合物包括編碼至少一種抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白選自猴痘病毒h3l蛋白、b6r蛋白、m1r蛋白、a35r蛋白、a29l蛋白、e8l蛋白、a30l蛋白、a5l蛋白、c19l蛋白或其同源蛋白中的一種或者多種，所述同源蛋白與上述蛋白具有至少75％同一性且與其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的蛋白或其抗原性片段，優(yōu)選地，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括h3l蛋白或其同源蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mrna組合物，其特征在于，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括兩種或者兩種以上的組合，所述兩種或者兩種以上的抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白分別表達(dá)或者融合表達(dá)，優(yōu)選地，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白分別表達(dá)，所述組合物包括多個(gè)mrna。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的mrna組合物，其特征在于，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋白包括如下表所示的組合：
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的mrna組合物，其特征在于，所述mrna序列是天然或修飾的rna，所述修飾的rna包括通過用修飾的尿苷部分或全部取代天然尿苷對(duì)rna進(jìn)行修飾；優(yōu)選地，所述mrna序列是修飾的rna，所述修飾的rna為通過用1-甲基-假尿苷(n1-methyl-pseudo-utp)對(duì)天然尿苷進(jìn)行全部替換。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的mrna組合物，其特征在于，所述mrna除包含上述編碼區(qū)外還包括5’帽子結(jié)構(gòu)，5’非編碼區(qū)，3’非編碼區(qū)和/或多聚腺苷酸尾的mrna序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的mrna組合物，其特征在于，所述抗原肽或結(jié)構(gòu)蛋...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李藎，吳漢，武云暉，胡晨龍，王浩猛，隋秀文，劉健，朱濤，邱東旭，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：康希諾上海生物研發(fā)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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