【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于細(xì)胞治療，具體涉及一種篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)具有多能性、自我更新能力、低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)功能和損傷趨化性，已證實(shí)人羊膜衍生間充質(zhì)干細(xì)胞(hammscs)不僅具有mscs的特征，而且還具有一些與胚胎干細(xì)胞相同的表型特征。羊膜位于胎盤的最內(nèi)層，主要由來源于外胚層的上皮細(xì)胞和來源于中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，不含血管，且細(xì)胞成分相對簡單，在胎兒出生后即成為廢棄品，從羊膜組織中獲取hammscs是安全、無創(chuàng)和符合倫理的，這些優(yōu)點(diǎn)使hammscs成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程的有前途的種子細(xì)胞。
2、根據(jù)中國食品藥品檢定研究院要求，hammscs在制作注射液前需要分別進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌、真菌和病毒檢查等安全性檢測，以及免疫反應(yīng)作為有限性檢測，但這些標(biāo)準(zhǔn)是基于mscs整體來檢測的，未針對hammscs給出特異性的指標(biāo)，對于hammscs的安全性檢測是足夠的，但無法準(zhǔn)確判斷hammscs用于治療疾病時(shí)的有效性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種篩選治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，確定了治療有效性的質(zhì)量控制指標(biāo)，保證人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的治療有效性。
2、本專利技術(shù)提供了一種篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
3、將過氧化氫處理后的卵巢顆粒細(xì)胞與人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行共培養(yǎng)，記為人羊膜來源間
4、將過氧化氫處理后的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，記為模型組；
5、根據(jù)培養(yǎng)后的卵巢顆粒細(xì)胞的存活率及分泌因子的含量進(jìn)行判斷：
6、當(dāng)與模型組相比，人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞處理組卵巢顆粒細(xì)胞的存活率有顯著升高，細(xì)胞的分泌因子含量有顯著降低，說明人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有卵巢功能減退的治療有效性；反之，則認(rèn)為無效。
7、優(yōu)選的，所述分泌因子包括tnf-α和/或tnf-r1。
8、優(yōu)選的，所述過氧化氫的處理濃度為1.6～2.4mm；
9、優(yōu)選的，所述過氧化氫的處理時(shí)間為1～4h；
10、人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞處理組卵巢顆粒細(xì)胞的存活率和細(xì)胞的分泌因子含量的檢測時(shí)間點(diǎn)包括培養(yǎng)1h、2h、3h和4h。
11、優(yōu)選的，所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法，將復(fù)蘇后的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞接種至msc-q完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離上清。
12、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3～4d。
13、優(yōu)選的，所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為(0.7～0.95)×104/cm2。
14、優(yōu)選的，所述分離上清包括離心和濾膜過濾；
15、所述離心的條件為3000rpm離心5min；所述濾膜過濾中濾膜的孔徑為0.22μm。
16、優(yōu)選的，還包括人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量控制常規(guī)檢測和有效性常規(guī)檢測；
17、所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量控制常規(guī)檢測包括細(xì)胞形態(tài)、活率檢測、細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測、間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化、成骨分化和成軟骨分化檢測；
18、人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的有效性常規(guī)檢測包括淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)、特定淋巴細(xì)胞亞群檢測和淋巴細(xì)胞分泌tnf-α抑制試驗(yàn)。
19、優(yōu)選的，還包括動物有效性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；
20、所述動物有效性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證包括卵巢早衰組織病理學(xué)檢查和相關(guān)分泌因子檢測；所述卵巢早衰組織病理學(xué)檢查的項(xiàng)目包括卵巢早衰相關(guān)病變、子宮、陰道和腎上腺；
21、所述相關(guān)分泌因子檢測包括ido相對表達(dá)量、vegf濃度和hgf濃度。
22、本專利技術(shù)提供了人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療卵巢功能減退的藥物中的應(yīng)用，所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞為所述方法篩選的有效治療的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞。本專利技術(shù)基于人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清與過氧化氫共同處理卵巢顆粒細(xì)胞(kgn)，通過檢測培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)的卵巢顆粒細(xì)胞活率及分泌因子，從而建立一種篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。本專利技術(shù)從分子、細(xì)胞層面對人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞治療卵巢功能減退進(jìn)行有效性驗(yàn)證，根據(jù)過氧化氫通過激發(fā)人卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞衰老凋亡的原理，通過采用過氧化氫刺激人卵巢顆粒細(xì)胞，模擬卵巢功能減退患者卵巢顆粒細(xì)胞炎癥環(huán)境下氧化應(yīng)激模型。通過人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清與過氧化氫處理的卵巢顆粒細(xì)胞，以人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清是否能夠緩解過氧化氫在不同時(shí)間點(diǎn)對kgn細(xì)胞活率的損傷以及是否能夠降低過氧化氫處理的人卵巢顆粒細(xì)胞中tnf-α、tnf-r1表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，建立一種篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。從細(xì)胞層面進(jìn)行體外藥效試驗(yàn)，結(jié)果更具說服力，同時(shí)補(bǔ)充相關(guān)分泌因子檢測及動物有效性實(shí)驗(yàn)，使人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞治療卵巢功能減退的有效性得到有力支撐。此項(xiàng)方法建立后有助于篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞，確保hammscs的治療卵巢功能減退(poi)有效性。
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1.一種篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述分泌因子包括TNF-α和/或TNF-R1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述過氧化氫的處理濃度為1.6～2.4mM；所述過氧化氫的處理時(shí)間為1～4h；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法，將復(fù)蘇后的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞接種至MSC-Q完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離上清。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3～4d。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為(0.7～0.95)×104/cm2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，還包括人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量控制常規(guī)檢測和有效性常規(guī)檢測；
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任意一項(xiàng)所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，還包括動物有效性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；
10.人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療卵巢功能減退的藥物中的應(yīng)用，所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞為權(quán)利要求1～9中任意一項(xiàng)所述方法篩選的有效治療的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述分泌因子包括tnf-α和/或tnf-r1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述過氧化氫的處理濃度為1.6～2.4mm；所述過氧化氫的處理時(shí)間為1～4h；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法，將復(fù)蘇后的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞接種至msc-q完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離上清。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述篩選有效治療卵巢功能減退的人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3～4d。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊袁，余思捷，鄭春兵，郭海春，劉云，顏騰龍，華江舟，
申請(專利權(quán))人：長沙干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)工業(yè)技術(shù)研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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