【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，特別涉及一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法。
技術(shù)介紹
1、隨著生活水平的提高，人們越來越注重保健和養(yǎng)生。然而，食糖過量導(dǎo)致患肥胖、糖尿病等慢性疾病的人群不斷增加，消費者談糖色變。稀有糖是自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物，具有低熱量、低吸收、生理活性顯著等特點，引起人們的廣泛關(guān)注。其中，稀有糖d-阿洛酮糖是近兩年備受矚目的一種天然功能性低熱量甜味劑，甜度約為蔗糖的70％，熱量僅為0.4kcal/g，是一種良好的蔗糖替代品，具有低熱減脂、保健、神經(jīng)保護、抗齲齒等生理功能。d-阿洛酮糖兼具口感和安全性優(yōu)勢，在膳食、醫(yī)藥和保健等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。
2、d-阿洛酮糖的來源有天然原料提取法、化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法，相比前兩種方法，生物轉(zhuǎn)化法具有操作簡單、成本低、得率高、環(huán)境友好等優(yōu)點，成為工業(yè)化生產(chǎn)d-阿洛酮糖的首選方法。生物轉(zhuǎn)化法主要分為酶生物轉(zhuǎn)化法和全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法。然而，酶生物轉(zhuǎn)化法需要破碎細(xì)胞、提取純化酶以及對酶進行固定化等操作，步驟繁瑣、成本高，而且酶作為生物催化劑對環(huán)境變化的抵抗力弱。因此，全細(xì)胞作為生物催化劑更加穩(wěn)定、高效、便捷。
3、目前，d-阿洛酮糖主要通過d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶催化d-果糖得到。但d-果糖成本高，產(chǎn)量有限，不利于作為大宗原料使用。然而，d-葡萄糖的價格遠低于d-果糖且產(chǎn)量大。葡萄糖異構(gòu)酶可以實現(xiàn)d-葡萄糖和d-果糖之間的相互轉(zhuǎn)化。通過將葡萄糖異構(gòu)酶與d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶級聯(lián)可以實現(xiàn)由廉價底物d-葡萄糖直
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法。
2、為實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
3、本專利技術(shù)提供了一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法，包括以下步驟：
4、(1)將d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因dpe連接到載體質(zhì)粒pma5的限制性酶切位點ndeⅰ和bamhⅰ之間，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pma5-dpe；
5、(2)將葡萄糖異構(gòu)酶基因gi連接到所述步驟(1)的重組質(zhì)粒pma5-dpe的限制性酶切位點nheⅰ和mluⅰ之間，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pma5-dpe-gi；
6、(3)將所述步驟(2)的重組質(zhì)粒pma5-dpe-gi轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌wb600中，至終濃度為10μg/ml，充分混勻后放入37℃恒溫水浴中靜置45min；繼而放入37℃，200rpm的搖床中培養(yǎng)3h；然后將菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb固體平板上，37℃靜置培養(yǎng)過夜；最后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至lb液體培養(yǎng)基中，并添加卡那霉素至濃度為50μg/ml，37℃，200rpm培養(yǎng)12h，篩選得到重組菌株wb600-pma5-dpe-gi；
7、(4)將所述步驟(3)的重組菌株wb600-pma5-dpe-gi接種到含有50μg/ml卡那霉素和1mm?fe3+的tb液體培養(yǎng)基中37℃，250rpm培養(yǎng)30h，培養(yǎng)后的菌液10000rpm離心5min收集菌體；將收集的菌體用雙蒸水洗滌菌體3次，10000rpm離心5min再次收集菌體；用含d-葡萄糖的底物溶液重懸菌體至od600為40-50，以構(gòu)建生物合成d-阿洛酮糖的反應(yīng)體系，置于68℃-72℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)10h-14h；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于14000rpm離心5min去除菌體，取上清液煮沸5min后再重復(fù)一次離心，取上清液經(jīng)0.22μm孔徑的超濾膜濾器過濾，得到濾液中含有d-阿洛酮糖。
8、進一步的，所述步驟(1)中的d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因dpe具有下列核苷酸序列之一：
9、(1)如seq?id?no.5所示的核苷酸序列；
10、(2)與seq?id?no.5所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且編碼與seq?id?no.4所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
11、進一步的，所述步驟(2)中的葡萄糖異構(gòu)酶基因gi具有下列核苷酸序列之一：
12、(1)如seq?id?no.3所示的核苷酸序列；
13、(2)與seq?id?no.3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且編碼與seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
14、進一步的，所述步驟(4)中含抗生素的培養(yǎng)基中還含有終濃度為0.9mm-1.1mm的fe3+，且所述重組菌株的培養(yǎng)溫度為36℃-38℃。
15、進一步的，所述步驟(4)中底物溶液d-葡萄糖的濃度為100g/l-900g/l，其中還含有濃度為20mm的磷酸氫二鈉；所述磷酸氫二鈉的ph調(diào)整為7.0。
16、進一步的，所述d-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率高于15％。
17、本專利技術(shù)還提供了一種重組菌株，其中同時含有d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因dpe和葡萄糖異構(gòu)酶基因gi，是利用所述方法中的步驟(1)-(3)制備獲得的。
18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果和優(yōu)點是：
19、1、本專利技術(shù)構(gòu)建了一株具有高底物耐受性的能夠催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌，當(dāng)?shù)孜飀-葡萄糖的濃度分別為100、600和900g/l時，反應(yīng)達到平衡所得d-阿洛酮糖的濃度分別為17.2、101.9和139.6g/l，對應(yīng)于d-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率分別為17.2、17.0和15.5％。
20、2、本專利技術(shù)所用pma5具有hpaⅱ強啟動子，不需要額外添加誘導(dǎo)劑即可表達蛋白，節(jié)省成本，而且選擇了具有高底物耐受性的來自于caldicellulosiruptor?bescii?dsm?6725的葡萄糖異構(gòu)酶與酶活穩(wěn)定的來自于ruminococcus?sp.5_1_39bfaa的d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進行雙酶級聯(lián)。本專利技術(shù)利用重組枯草芽孢桿菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法催化d-葡萄糖生產(chǎn)d-阿洛酮糖，細(xì)胞催化劑易得，操作簡單，反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)效率高且成本低，省時省力。當(dāng)?shù)孜飀-葡萄糖的濃度為900g/l時，雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌仍具有很高的細(xì)胞催化活性，生成d-阿洛酮糖的濃度高達139.6g/l，d-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為15.5％。
21、3、本專利技術(shù)提供了一株具有高底物耐受性的可用于生產(chǎn)食品級d-阿洛酮糖的重組枯草芽孢桿菌菌株，具有顯著的工業(yè)化應(yīng)用潛力，也可為其它稀有糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。
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1.一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因dpe具有下列核苷酸序列之一：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的葡萄糖異構(gòu)酶基因gi具有下列核苷酸序列之一：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中含抗生素的培養(yǎng)基中還含有終濃度為0.9mM-1.1mM的Fe3+，且所述重組菌株的培養(yǎng)溫度為36℃-38℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中底物溶液D-葡萄糖的濃度為100g/L-900g/L，其中還含有濃度為20mM的磷酸氫二鈉；所述磷酸氫二鈉的pH調(diào)
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中底物溶液重懸菌體后，將其置于68℃-72℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)10h-14h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中過濾采用的是0.22μm孔徑的超濾膜濾器。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)中載體質(zhì)粒為pMA5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化D-葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率高于15％。
10.一種重組菌株，其特征在于，所述重組菌株中同時含有D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因dpe和葡萄糖異構(gòu)酶基因gi，其是利用權(quán)利要求1所述的方法中的步驟(1)-(3)制備獲得的。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的d-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因dpe具有下列核苷酸序列之一：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的葡萄糖異構(gòu)酶基因gi具有下列核苷酸序列之一：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中含抗生素的培養(yǎng)基中還含有終濃度為0.9mm-1.1mm的fe3+，且所述重組菌株的培養(yǎng)溫度為36℃-38℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙酶級聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中底物溶液d-葡萄糖的濃度為100g/l-900g/l，其中還含有濃度為20mm...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：林建強，溫鑫，林建群，宋欣，
申請(專利權(quán))人：青島龍鼎生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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