【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及一種分選激活磁珠的偶聯方法及應用，具體涉及cd3/cd28。
技術介紹
1、磁珠偶聯技術是以生物學為基礎，生物信息學、臨床醫學、材料學等交叉學科共同組成，其主要應用于細胞分離、蛋白質及核酸純化、免疫檢測等等，隨著磁珠偶聯技術日趨成熟，以及細胞治療領域的快速發展，為磁珠偶聯抗體領域帶來了廣大的應用前景。
2、磁珠可根據結構不同分為三類：1.核殼式：磁珠最早采用的結構，聚合物完全包被磁珠內核的磁性顆粒。2.夾心式：磁珠內核及外層結構為聚合物，中間層為磁性顆粒，工藝難度相對核殼式更高。3.彌散式：磁性顆粒隨機分布于聚合物微球中，是目前較為成熟的工藝。
3、相較于瓊脂糖珠，磁珠作為整個免疫反應的載體具有顯著優越性：
4、1)與瓊脂糖珠磁珠海綿狀多孔結構不同，磁珠表面粗糙程度較低，抗體只結合于磁珠表面，可提高抗體與磁珠的結合效率，減少非特異性結合。
5、2)通過磁性分離能夠快速富集免疫磁珠，大大縮短反應時間。由于吸取上清時不需要離心，所以還能夠降低免疫磁珠丟失的概率。
6、3)粒徑較小的納米磁珠呈膠體狀，能夠均勻懸浮于反應溶液中，增加免疫磁珠與樣本的接觸機會，從而加快反應速度，提高免疫磁珠與樣本的結合效率。
7、4)磁珠具有磁響應性(又稱超順磁性)，可以通過外加磁場收集磁珠，撤除磁場后磁珠的磁性消失，隨后重新均勻分散在溶液中。且磁珠能夠通過共聚及表面改性等方法賦予其表面功能基，例如羥基、羧基、巰基和氨基等功能基團，通過這些基團可以和目的分子進行
技術實現思路
1、為了解決現有技術中存在的技術問題，提供以下技術方案：
2、本專利技術提供了一種磁珠的偶聯方法，所述偶聯方法包括：
3、1)磁珠充分混勻，加入不同ph值的mes?buffer重懸，混勻，磁力架上靜置后棄上清，重復步驟1)多次；
4、2)加入與步驟1)對應ph值的mes?buffer重懸，加入edc，混勻1h；
5、3)加入pbs重懸，混勻，磁力架上靜置后棄上清，重復步驟3)多次；
6、4)加入pbs重懸磁珠，加入nhs，混勻1h；
7、5)加入pbs重懸，混勻，磁力架上靜置后棄上清，重復步驟5)多次；
8、6)加入pbs重懸磁珠，加入cd3、cd28單克隆抗體原液，混勻2.5h，磁力架上靜置后棄上清；
9、7)加入pbs重懸，混勻，磁力架上靜置后棄上清，重復步驟7)多次；
10、8)加入封閉buffer重懸磁珠，混勻1h；
11、9)磁力架上靜置后棄上清；
12、10)加入保存液buffer重懸，混勻，磁力架上靜置后棄上清，重復步驟10)多次；
13、11)加入保存液buffer重懸磁珠，得到偶聯磁珠。
14、在某些具體的實施方案中，所述磁珠原料為1-10μm粒徑，在某個具體的實施方案中，所述磁珠原料為1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm。
15、術語“磁珠”是指具有超強的順磁性的細小粒徑的微球，在磁場中能夠迅速聚集，離開磁場后又能夠有助于磁分離地均勻分散。其次，具有合適的且差別較小的粒徑，保證了足夠強的磁響應性又不會沉降。再次，具有豐富的表面活性基團，以便可以和生化物質偶聯，并在外磁場的作用下實現與被待測樣品的分離。與傳統的分離方法相比，把磁珠用于生化樣品復雜組分的分離，能夠實現分離和富集的同時進行，有效地提高了分離速度和富集效率，同時也使分析檢測的靈敏度大大提升。
16、進一步，所述磁珠包括氨基磁珠、羧基磁珠、環氧基磁珠、巰基磁珠、無包被磁珠。
17、在某些具體的實施方案中，所述磁珠為羧基磁珠。
18、術語“重懸”是指在進行洗滌時故意將沉降的沉淀物放回到懸液中并將其保持在懸液中的行為。
19、術語“cd3抗體”、“cd3單克隆抗體”通常是指能夠特異性識別cd3亞基(例如，cd3epsilon、cd3?gamma、cd3?delta，或上述的復合物)的抗體，該抗體可以為只能夠識別cd3的單克隆抗體，或者是可以同時識別cd3和其他靶點的多靶點抗體。
20、術語“cd28抗體”、“cd28單克隆抗體”通常是指能夠特異性識別cd28亞基(例如，cd28?epsilon、cd28?gamma、cd28?delta，或上述的復合物)的抗體，該抗體可以為只能夠識別cd28的單克隆抗體，或者是可以同時識別cd28和其他靶點的多靶點抗體。
21、在本申請中，術語“cd3”、“cd28”指來自任何脊椎動物來源的任何天然cd3/cd28，包括哺乳動物，諸如靈長動物(例如人)，非人靈長動物(例如食蟹猴)和嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)。該術語涵蓋“全長”和未加工的cd3/cd28蛋白質以及源自細胞中加工的任何形式的蛋白質或一種或多種cd3/cd28鏈(多肽)(例如成熟多肽)。該術語還涵蓋cd3/cd28的天然發生變體和同等型，例如剪接變體或等位變體。
22、同樣的，本申請的術語“cd3?epsilon”、“cd28?epsilon”、“cd3?gamma”、“cd28gamma”、“cd3?delta”和/或“cd28?delta”指來自任何脊椎動物來源的任何天然cd3/cd28，包括哺乳動物，諸如靈長動物(例如人)，非人靈長動物(例如食蟹猴)和嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)?！癱d3?epsilon”、“cd28?epsilon”、“cd3?gamma”、“cd28?gamma”、“cd3delta”和/或“cd28?delta”分別涵蓋“全長”和未加工的“cd3?epsilon”、“cd28?epsilon”、“cd3?gamma”、“cd28?gamma”、“cd3?delta”和/或“cd28?delta”蛋白質以及源自細胞中加工的任何形式的cd3/cd28鏈(多肽)(例如成熟多肽)。該術語還涵蓋cd3/cd28鏈的天然發生變體和同等型，例如剪接變體或等位變體。
23、術語“cd28”是指蛋白質分化抗原簇28，其是在t細胞上表達的提供t細胞活化和存活所需的共刺激信號的蛋白質之一。
24、術語“cd3”是指一種多聚體蛋白復合物，歷史上稱為t3復合物，由4條不同的多肽鏈組成。ε(ε)、γ(γ)、δ(δ)和ζ(ζ)，它們組裝并作為三對二聚體(εγ、εδ、ζζ)發揮作用。
25、進一步，所述偶聯方法步驟1)中ph值范圍為4.5-6.5。
26、在某些具體的實施方案中，所述mes?buffer的ph值為4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種磁珠的偶聯方法，其特征在于，所述偶聯方法包括：
2.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述偶聯方法步驟1)中pH值范圍為4.5-6.5；
3.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述MES?buffer組分為MES：注射用水＝1.59g：50mL，pH值調整為4.5-6.5。
4.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述PBS組分為NaCl：KCl：Na2HPO4：KH2PO4：注射用水＝8g：0.2g：1.44g：0.24g：1L。
5.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述步驟2)中EDC的濃度為1mg/mL，1mg/mL?EDC的組分為EDC：MES＝0.01g：10mL，所述EDC需要即用即配；
6.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述封閉buffer的組分為20mM?PBS、1％BSA；
7.一種根據權利要求1-6任一項所述的磁珠的偶聯方法獲得的分選激活磁珠。
8.一種根據權利要求1-6任一項所述的磁珠的偶聯方法獲得的分選激活磁珠在制備產品中
9.一種根據權利要求1-6任一項所述的磁珠的偶聯方法獲得的分選激活磁珠在促進T細胞分選、激活和/或擴增中的應用。
10.一種根據權利要求1-6任一項所述的磁珠的偶聯方法獲得的分選激活磁珠在提升T細胞純度中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種磁珠的偶聯方法，其特征在于，所述偶聯方法包括：
2.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述偶聯方法步驟1)中ph值范圍為4.5-6.5；
3.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述mes?buffer組分為mes：注射用水＝1.59g：50ml，ph值調整為4.5-6.5。
4.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述pbs組分為nacl：kcl：na2hpo4：kh2po4：注射用水＝8g：0.2g：1.44g：0.24g：1l。
5.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特征在于，所述步驟2)中edc的濃度為1mg/ml，1mg/ml?e...
【專利技術屬性】
技術研發人員：邱志宇，王巧玲，喬倩，楊麗微，陳曉通，王立燕，
申請(專利權)人：北京同立海源生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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