【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學檢測，具體涉及用于檢測猴痘病毒的引物對、引物組合物、方法和試劑盒。
技術介紹
1、猴痘是由猴痘病毒(monkeypox?virus，mpxv)感染引起的人畜共患疾病。臨床上主要表現為發熱、皮疹、淋巴結腫大。mpxv屬于痘病毒科正痘病毒屬，是一種有包膜的雙鏈dna病毒。該病主要通過動物傳播，人類可以被感染動物的咬傷或者直接接觸感染動物的血液、體液和皮疹而感染猴痘，其潛伏期通常為7至14天，癥狀持續時間2至4周，致死率在0％～11％之間，絕大多數患者可康復。目前還沒有針對mpxv的針對性治療方案。因此，準確的檢測對于早期發現病例、快速鑒別診斷和控制病毒傳播至關重要。
2、目前，mpxv感染的實驗室檢測方法主要包括病毒分離培養、電鏡活檢、血清學免疫檢測、分子生物學檢測等，其中，最常使用的方法為基于taqman探針的熒光定量pcr法。該技術主要利用了taq酶的5′外切酶活性。首先合成一個能與pcr產物雜交的探針，探針的5′端標記一種熒光分子，3′標記一種相應的熒光淬滅分子，3′端淬滅分子能夠吸收5′端熒光分子發出的熒光。正常情況下該探針理論上不發出熒光，但當溶液中有pcr產物時，探針與pcr產物結合，激活taq酶的5′端外切酶活性，將探針切割成單核苷酸，與此同時，標記在探針上的熒光基團游離出來，導致發出熒光，且切割的熒光分子數與pcr產物的數量成正比。因此，根據pcr反應液中熒光信號強度即可計算出初始模板的濃度。taqman探針技術盡管應用廣泛，但仍存在一些缺陷，如線性探針的長度限制了能量轉移效率，淬
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是提供一種猴痘病毒的檢測方法。所要解決的技術問題不限于所描述的技術主題，本領域技術人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術主題。
2、為解決上述技術問題，本專利技術提供了以下技術方案：
3、本專利技術提供了用于檢測猴痘病毒的引物對，所述引物對由mpxv-f和mpxv-r組成，所述mpxv-f為核苷酸序列是seq?id?no.1的單鏈dna分子，所述mpxv-r為核苷酸序列是seqid?no.2的單鏈dna分子。
4、本專利技術提供了用于檢測猴痘病毒的引物探針組合物，所述引物探針組合物包括mpxv正義鏈探針mpxv-p1、mpxv反義鏈探針mpxv-p2、前述mpxv-f和mpxv-r，所述mpxv-p1為核苷酸序列是seq?id?no.3的單鏈dna分子，所述mpxv-p2為核苷酸序列是seq?id?no.4的單鏈dna分子。
5、進一步地，上述引物探針組合物中，所述mpxv正義鏈探針mpxv-p1和mpxv反義鏈探針mpxv-p2的5’端標記熒光基團，3’端修飾有mgb。
6、進一步地，上述引物探針組合物中還包括人管家基因gpi上游引物gpi-f、人管家基因gpi下游引物gpi-r和人管家基因gpi探針gpi-p。其中gpi上游引物gpi-f、人管家基因gpi下游引物gpi-r和人管家基因gpi探針gpi-p的摩爾比為7：7：6。
7、進一步地，上述引物探針組合物中，所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正義鏈探針mpxv-p1和mpxv反義鏈探針mpxv-p2的摩爾比為2:2:1:1。
8、進一步地，所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正義鏈探針mpxv-p1和mpxv反義鏈探針mpxv-p2、gpi上游引物gpi-f、人管家基因gpi下游引物gpi-r和人管家基因gpi探針gpi-p的摩爾比為0.72:0.72:0.36:0.36:0.07:0.07:0.06。
9、本專利技術提供了用于檢測猴痘病毒的試劑盒，所述試劑盒包含前述的引物對或包含前述的引物探針組合物。
10、進一步地，上述試劑盒中還包括dntp、尿嘧啶糖基化酶、dna聚合酶、pcr緩沖液以及mg2+中的至少一種。
11、進一步地，上述試劑盒中還包括陽性對照品和陰性對照品，陽性對照品為monkeypox?virus-f3l假病毒，monkeypox?virus-f3l假病毒是將猴痘病毒的部分dna序列構建到病毒樣顆粒載體(virus?like?particles，vlps)載體上得到的，陰性對照品為生理鹽水。
12、本專利技術提供了檢測猴痘病毒的方法，所述方法包括使用前述引物探針組合物對待測樣品進行pcr擴增反應，根據擴增結果確定待測樣品是否含有猴痘病毒。
13、進一步地，上述方法中，所述pcr擴增反應中的所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正義鏈探針mpxv-p1和mpxv反義鏈探針mpxv-p2的摩爾比為2:2:1:1。
14、進一步地，上述方法中，pcr擴增反應的退火溫度為55℃。
15、上述方法中，所述待測樣品可包括皰液、口咽拭子、唾液或尿液樣本。
16、前述引物對或引物探針組合物在檢測猴痘病毒或制備檢測猴痘病毒的產品中的應用也屬于本專利技術保護的范圍。
17、上述應用或方法可為非疾病診斷的應用或方法。上述應用或方法可不以獲得有生命的人體或動物體的疾病診斷結果或健康狀況為直接目的。所述待測樣品可為來自非有生命的人體或動物體的樣品，如環境樣品(如空氣)、食品(如冷凍食品或新鮮食品)。
18、本專利技術所設計的部分互補雙鏈雙淬滅寡核苷酸核酸探針中的熒光基團和淬滅基團的距離比taqman探針的更近，使用雙淬滅方式，淬滅更徹底，大大降低了熒光本底。另外，雙探針可釋放出更多熒光基團，信號更強，該技術提高了檢測靈敏度。本專利技術的猴痘檢測方法具有高靈敏、高特異性，靈敏度可達50拷貝/ml，可有效降低猴痘病毒低載量樣本的漏檢。
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1.用于檢測猴痘病毒的引物對，其特征在于，所述引物對由MPXV-F和MPXV-R組成，所述MPXV-F為核苷酸序列是SEQ?ID?No.1的單鏈DNA分子，所述MPXV-R為核苷酸序列是SEQ?IDNo.2的單鏈DNA分子。
2.用于檢測猴痘病毒的引物探針組合物，其特征在于，所述引物探針組合物包括MPXV正義鏈探針MPXV-P1、MPXV反義鏈探針MPXV-P2、權利要求1中所述MPXV-F和MPXV-R，所述MPXV-P1為核苷酸序列是SEQ?ID?No.3的單鏈DNA分子，所述MPXV-P2為核苷酸序列是SEQ?IDNo.4的單鏈DNA分子。
3.根據權利要求2所述的引物探針組合物，其特征在于，所述MPXV正義鏈探針MPXV-P1和MPXV反義鏈探針MPXV-P2的5’端標記熒光基團，3’端修飾有MGB。
4.根據權利要求2或3所述的引物探針組合物，其特征在于，所述引物探針組合物中，所述MPXV-F、MPXV-R、MPXV正義鏈探針MPXV-P1和MPXV反義鏈探針MPXV-P2的摩爾比為2:2:1:1。
5.用于檢測猴痘病毒的
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTP、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR緩沖液以及Mg2+中的至少一種。
7.檢測猴痘病毒的方法，其特征在于，所述方法包括使用權利要求2-4任一所述引物探針組合物對待測樣品進行PCR擴增反應，根據擴增結果確定待測樣品是否含有猴痘病毒。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應中的所述MPXV-F、MPXV-R、MPXV正義鏈探針MPXV-P1和MPXV反義鏈探針MPXV-P2的摩爾比為2:2:1:1，所述PCR擴增反應的退火溫度為55℃。
9.權利要求1所述的引物對在檢測猴痘病毒或制備檢測猴痘病毒的產品中的應用。
10.權利要求2所述的引物探針組合物在檢測猴痘病毒或制備檢測猴痘病毒的產品中的應用。
...【技術特征摘要】
1.用于檢測猴痘病毒的引物對，其特征在于，所述引物對由mpxv-f和mpxv-r組成，所述mpxv-f為核苷酸序列是seq?id?no.1的單鏈dna分子，所述mpxv-r為核苷酸序列是seq?idno.2的單鏈dna分子。
2.用于檢測猴痘病毒的引物探針組合物，其特征在于，所述引物探針組合物包括mpxv正義鏈探針mpxv-p1、mpxv反義鏈探針mpxv-p2、權利要求1中所述mpxv-f和mpxv-r，所述mpxv-p1為核苷酸序列是seq?id?no.3的單鏈dna分子，所述mpxv-p2為核苷酸序列是seq?idno.4的單鏈dna分子。
3.根據權利要求2所述的引物探針組合物，其特征在于，所述mpxv正義鏈探針mpxv-p1和mpxv反義鏈探針mpxv-p2的5’端標記熒光基團，3’端修飾有mgb。
4.根據權利要求2或3所述的引物探針組合物，其特征在于，所述引物探針組合物中，所述mpxv-f、mpxv-r、mpxv正義鏈探針mpxv-p1和mpxv反義鏈探針mpx...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王升啟，榮振，韓勇軍，王運祥，劉麗艷，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，
類型：發明
國別省市：
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