【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，具體涉及一種富含n-3脂肪酸裂壺藻藻株及其篩選、培養(yǎng)。
技術(shù)介紹
1、n-3脂肪酸是一類多元不飽和脂肪酸，主要包括二十碳五烯酸(c20:5,cis-5,8,11,14,17，epa)，二十二碳五烯酸(c22:5,cis-7,10,13,16,19，n-3dpa)以及二十二碳六烯酸(c22:6,cis-4,7,10,13,16,19，dha)等，存在于深海海洋動物以及海洋微生物中。n-3脂肪酸是人類必需的營養(yǎng)活性物質(zhì)，對人體的神經(jīng)發(fā)育和慢性疾病的預(yù)防有著重要的作用。傳統(tǒng)n-3脂肪酸的來源是從魚油中獲取，但由于海洋資源日益枯竭、頻繁出現(xiàn)海洋污染等多方面原因，高質(zhì)量魚油的供應(yīng)已經(jīng)大幅度的下降。海洋微藻作為n-3脂肪酸的最初生產(chǎn)者，其發(fā)酵過程安全可控、無需占用土地資源，是可替代魚油的綠色可持續(xù)性發(fā)展來源。
2、裂殖壺菌是目前商業(yè)生產(chǎn)中最重要的產(chǎn)油微藻之一，多以生產(chǎn)dha為主，其產(chǎn)量可達40g/l。此外，裂壺藻也能同時生產(chǎn)epa和n-3dpa等不飽和脂肪酸，但野生型菌株合成epa和n-3dpa的能力有限、無法滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)所需。因此，探究裂壺藻同時高含量n-3脂肪酸一直是相關(guān)學(xué)者研究的熱點。大量研究表明，裂壺藻生產(chǎn)脂肪酸的途徑主要分為脂肪酸合成酶途徑和酮聚合酶途徑。其中脂肪酸合成酶途徑是大都微生物都具備的，主要涉及脂肪酸前體物質(zhì)的一系列脫水、縮合、延長等步驟。脂肪酸合成首先利用乙酰輔酶a和丙二酰輔酶a反應(yīng)合成棕櫚酸(c16:00)，棕櫚酸再通過延長酶和去飽和酶的催化下合成亞油酸(c18:2n-6),之后在δ
3、因此，尋找理想的菌種誘變、菌種馴化和基因工程等手段方法，增強裂壺藻脂肪酸合成酶的n-3途徑以提高epa和n-3dpa的含量具有較大需求。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供誘變裂壺藻菌的培養(yǎng)基和篩選裂壺藻菌的培養(yǎng)基，通過合適的誘變方法和篩選方法，獲得了一株裂壺藻菌，該菌株中epa和dpa與原始菌株相比，大大提高，該菌種遺傳穩(wěn)定性好，生長速度快，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
2、具體的，一方面，本專利技術(shù)提供了一株裂壺藻菌，名稱為裂壺藻hs08；保藏信息：保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號為cgmcc?no.40902。
3、另一方面，本專利技術(shù)提供了一種誘變裂壺藻菌的誘變培養(yǎng)基，所述誘變培養(yǎng)基含有誘變劑，所述誘變劑選自亞硝基呱、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯中的一種或多種；所述誘變劑的濃度是0.1％-5.0％；
4、在一些實施例中，所述誘變劑為0.5～2％甲基磺酸乙酯或0.5～2％硫酸二乙酯；優(yōu)選地，所述誘變劑為1％甲基磺酸乙酯或1％硫酸二乙酯。
5、在一些實施例中，所述誘變培養(yǎng)基還含有葡萄糖40～60g/l、酵母浸粉9～15g/l、無水硫酸鈉15～20g/l、氯化鉀0.5～1g/l、七水硫酸鎂3～5g/l、硫酸鉀0.25-～0.9g/l、磷酸二氫鉀0.5～3.5g/l、硫酸銨0.5～3.5g/l和無水氯化鈣0.1～2g/l，ph值自然；
6、在一些實施例中，所述誘變培養(yǎng)基中，葡萄糖50g/l、酵母浸粉10g/l、無水硫酸鈉15g/l、氯化鉀0.5g/l、七水硫酸鎂4.1g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1.0g/l、硫酸銨1.0g/l、無水氯化鈣0.17g/l。
7、另一方面，本專利技術(shù)提供了一種篩選裂壺藻菌的篩選培養(yǎng)基，所述篩選培養(yǎng)基含有篩選劑，所述篩選劑選自精喹禾靈、淺藍菌素、vb12、二苯胺中的一種或多種；淺藍菌素的濃度為0.001～1mm，精喹禾靈的濃度為0.001～1mm、二苯胺的濃度為0.001～1mm，vb12的濃度為1～100ug/l。
8、在一些實施例中，精喹禾靈的濃度為0.01～0.08mm；淺藍菌素的濃度為0.01～0.02mm；vb12的濃度為0.01ug/l。
9、在一些實施例中，所述篩選培養(yǎng)基還含有葡萄糖40-60g/l、酵母浸粉9～15g/l、無水硫酸鈉15～20g/l、氯化鉀0.5～1g/l、七水硫酸鎂3～5g/l、硫酸鉀0.25～0.9g/l、磷酸二氫鉀0.5～3.5g/l、硫酸銨0.5～3.5g/l、無水氯化鈣0.1～2g/l、瓊脂粉5～20g/l，ph值自然。
10、在一些實施例中，所述篩選培養(yǎng)基中，葡萄糖50g/l、酵母浸粉12g/l、無水硫酸鈉15g/l、氯化鉀0.5g/l、七水硫酸鎂4.1g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1.0g/l、硫酸銨1.0g/l、無水氯化鈣0.17g/l、瓊脂粉10g/l。
11、另一方面，本專利技術(shù)提供了一種裂壺藻菌篩選方法，包括步驟：
12、(1)將裂壺藻菌種接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，得到裂壺藻種子液；
13、(2)吸取種子液，離心棄去上清液用ph＝8.0的磷酸緩沖液清洗并重懸得到種子懸液；將種子懸液接種至本專利技術(shù)所述的誘變培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得突變裂壺藻液；
14、(3)吸取突變裂壺藻液，用ph＝8.0的磷酸緩沖液稀釋至一定梯度，然后吸取稀釋的突變裂壺藻液涂布于本專利技術(shù)所述的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
15、(4)挑選出生長速度快，邊緣規(guī)整的單一菌落涂布于本專利技術(shù)所述的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
16、(5)將挑出生長速度快，大小適中的菌落轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后保種，得到擬純化高產(chǎn)裂壺藻菌菌株。
17、(2)中，ph＝8.0的磷酸緩沖液清洗并重懸是ph＝8.0的磷酸緩沖液清洗并ph＝8.0的磷酸緩沖液重懸。
18、在一些實施例中，裂壺藻菌種為hs01裂壺藻種，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號為cgmcc?no.13746。
19、在一些實施例中，所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖40～60g/l、酵母浸粉9～15g/l、無水硫酸鈉15～20g/l、氯化鉀0.5～1g/l、七水硫酸鎂3～5g/l、硫酸鉀0.25～0.9g/l、磷酸二氫鉀0.5～3.5g/l、硫酸銨0.5～3.5g/l和無水氯化鈣0.1～2g/l，ph值自然。
20、在一些實施例中，所述種子培養(yǎng)基中，葡萄糖50g/l、酵母浸粉12g/l、無水硫酸鈉15g/l、氯化鉀0.5g/l、七水硫酸鎂4.1g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1.0g/l、硫酸銨1.0g/l和無水氯化鈣0.17g/l。
21、在一些實施例中，步驟(2)是在28℃、180r/min培養(yǎng)1-6h。
22、在一些實施例中，步驟(3)是在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h。
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【技術(shù)保護點】
1.一株裂壺藻菌，名稱為裂壺藻HS08；保藏信息：保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC?No.40902。
2.一種誘變裂壺藻菌的誘變培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘變培養(yǎng)基含有誘變劑，所述誘變劑選自亞硝基呱、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯中的一種或多種；所述誘變劑的濃度是0.1％-5.0％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘變培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘變劑為0.5～2％甲基磺酸乙酯或0.5～2％硫酸二乙酯；優(yōu)選地，所述誘變劑為1％甲基磺酸乙酯或1％硫酸二乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘變培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘變培養(yǎng)基還含有葡萄糖40～60g/L、酵母浸粉9～15g/L、無水硫酸鈉15～20g/L、氯化鉀0.5～1g/L、七水硫酸鎂3～5g/L、硫酸鉀0.25-～0.9g/L、磷酸二氫鉀0.5～3.5g/L、硫酸銨0.5～3.5g/L和無水氯化鈣0.1～2g/L，pH值自然；優(yōu)選地，所述誘變培養(yǎng)基中，葡萄糖50g/L、酵母浸粉10g/L、無水硫酸鈉15g/L、氯化鉀0.5g/L、七水硫酸鎂4.1g/L、硫酸鉀
5.一種篩選裂壺藻菌的篩選培養(yǎng)基，其特征在于，所述篩選培養(yǎng)基含有篩選劑，所述篩選劑選自精喹禾靈、淺藍菌素、VB12、二苯胺中的一種或多種；淺藍菌素的濃度為0.001～1mM，精喹禾靈的濃度為0.001～1mM、二苯胺的濃度為0.001～1mM，VB12的濃度為1～100ug/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選培養(yǎng)基，其特征在于，精喹禾靈的濃度為0.01～0.08mM；淺藍菌素的濃度為0.01～0.02mM；VB12的濃度為0.01ug/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的篩選培養(yǎng)基，其特征在于，所述篩選培養(yǎng)基還含有葡萄糖40-60g/L、酵母浸粉9～15g/L、無水硫酸鈉15～20g/L、氯化鉀0.5～1g/L、七水硫酸鎂3～5g/L、硫酸鉀0.25～0.9g/L、磷酸二氫鉀0.5～3.5g/L、硫酸銨0.5～3.5g/L、無水氯化鈣0.1～2g/L、瓊脂粉5～20g/L，pH值自然；優(yōu)選地，所述篩選培養(yǎng)基中，葡萄糖50g/L、酵母浸粉12g/L、無水硫酸鈉15g/L、氯化鉀0.5g/L、七水硫酸鎂4.1g/L、硫酸鉀0.65g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、硫酸銨1.0g/L、無水氯化鈣0.17g/L、瓊脂粉10g/L。
8.一種裂壺藻菌篩選方法，其特征在于，包括步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的篩選方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖40～60g/L、酵母浸粉9～15g/L、無水硫酸鈉15～20g/L、氯化鉀0.5～1g/L、七水硫酸鎂3～5g/L、硫酸鉀0.25～0.9g/L、磷酸二氫鉀0.5～3.5g/L、硫酸銨0.5～3.5g/L和無水氯化鈣0.1～2g/L，pH值自然；優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基中，葡萄糖50g/L、酵母浸粉12g/L、無水硫酸鈉15g/L、氯化鉀0.5g/L、七水硫酸鎂4.1g/L、硫酸鉀0.65g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、硫酸銨1.0g/L和無水氯化鈣0.17g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)是在28℃、180r/min培養(yǎng)1-6h；和/或
...【技術(shù)特征摘要】
1.一株裂壺藻菌，名稱為裂壺藻hs08；保藏信息：保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號為cgmcc?no.40902。
2.一種誘變裂壺藻菌的誘變培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘變培養(yǎng)基含有誘變劑，所述誘變劑選自亞硝基呱、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯中的一種或多種；所述誘變劑的濃度是0.1％-5.0％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘變培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘變劑為0.5～2％甲基磺酸乙酯或0.5～2％硫酸二乙酯；優(yōu)選地，所述誘變劑為1％甲基磺酸乙酯或1％硫酸二乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘變培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘變培養(yǎng)基還含有葡萄糖40～60g/l、酵母浸粉9～15g/l、無水硫酸鈉15～20g/l、氯化鉀0.5～1g/l、七水硫酸鎂3～5g/l、硫酸鉀0.25-～0.9g/l、磷酸二氫鉀0.5～3.5g/l、硫酸銨0.5～3.5g/l和無水氯化鈣0.1～2g/l，ph值自然；優(yōu)選地，所述誘變培養(yǎng)基中，葡萄糖50g/l、酵母浸粉10g/l、無水硫酸鈉15g/l、氯化鉀0.5g/l、七水硫酸鎂4.1g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1.0g/l、硫酸銨1.0g/l、無水氯化鈣0.17g/l。
5.一種篩選裂壺藻菌的篩選培養(yǎng)基，其特征在于，所述篩選培養(yǎng)基含有篩選劑，所述篩選劑選自精喹禾靈、淺藍菌素、vb12、二苯胺中的一種或多種；淺藍菌素的濃度為0.001～1mm，精喹禾靈的濃度為0.001～1mm、二苯胺的濃度為0.001～1mm，vb12的濃度為1～100ug/l。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選培養(yǎng)基，其特征在于，精喹禾靈的...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳禮毅，鐘惠昌，陳水榮，曾勝麗，
申請(專利權(quán))人：廈門匯盛生物有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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