【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其是涉及一種bst?dna聚合酶突變體和應用、肺炎鏈球菌檢測試劑盒。
技術介紹
1、肺炎鏈球菌(s.pneumoniae)為革蘭陽性球菌，常成對或成短鏈狀排列，是上呼吸道正常的寄居菌群，當免疫力降低時入侵機體，引起肺炎、腦膜炎、中耳炎等侵襲性疾病。全球每年有160萬人死于肺炎鏈球菌性疾病，其中70-100萬例為5歲以下兒童，占5歲以下兒童死亡總數的11％。因此快速準確的臨床檢測，對于后期的治療和康復起到了十分重要的作用。
2、在患病早期，通過及時快速的診斷出病原體，及早反應出臨床感染，對于患者的后期治療提供正確的方向。然而，目前實驗室檢測肺炎鏈球菌的為病原體分離培養、血清學檢測和分子生物學檢測。已知，肺炎鏈球菌的生長和鑒定通常需要兩天以上，操作復雜，尤其在患病初期，極有可能因為病原體數量較少出現假陰性，這種延誤的診斷可能會導致患者的預后不佳。病原體血清抗原檢測因此靈敏度低，限制了其在臨床實驗室的廣泛應用。pcr技術因高敏感性和高特異性等優點，快速成為首推的重要的檢測手段之一，但是由于pcr技術依賴特定場所，儀器，以及需要專業的操作人員等問題，不適合病原體檢測的常規開展。
3、環介導等溫擴增(loop-mediated?isothermal?amplification，lamp)是一種體外恒溫擴增技術，利用一種具有鏈置換活性的bst?dna聚合酶，和傳統核酸技術相比，避免常規pcr對溫度循環的特殊要求、高效靈敏，其在60min擴增效率可達109-1010個數量級、特異性強，費用低、操作
4、同時，lamp產物的結果判讀形式多樣化，且不同的判讀方法有或多或少的問題存在。檢測手段主要包括瓊脂糖凝膠電泳、焦磷酸鎂濁度檢測、熒光定量檢測和目測等。其中瓊脂糖凝膠電泳需要開蓋檢測，容易造成氣溶膠污染。熒光定量檢測則需要特殊儀器，檢測成本較高。濁度檢測同樣需要濁度檢測儀的輔助進行結果判讀。
5、綜上所述，現有的肺炎鏈球菌的傳統檢測方式存在檢測速度慢、靈敏度較差、操作繁瑣復雜、場地依賴及專業性限制性強等劣勢，改進上述缺陷是目前肺炎鏈球菌檢測產品亟需解決的問題。
6、有鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種bst?dna聚合酶突變體，以緩解現有技術中bst?dna聚合酶鏈置換能力弱，產物得率低等問題，以及基于該bst?dna聚合酶突變體的應用和lamp擴增反應試劑或試劑盒。
2、本專利技術的另一目的在于提供一種肺炎鏈球菌lamp檢測試劑盒，以緩解前述肺炎鏈球菌檢測產品中的至少一種缺陷。
3、為解決上述技術問題，本專利技術特采用如下技術方案：
4、第一方面，提供了一種bst?dna聚合酶突變體，該bst?dna聚合酶突變體含有如下突變：對應于seq?id?no.1所示的氨基酸序列，存在t186l、g311k、t488e和e557r突變。
5、可選的實施方式中，所述bst?dna聚合酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
6、第二方面，還提供了第一方面的bst?dna聚合酶突變體在lamp擴增反應，或制備用于實現lamp擴增反應的試劑或試劑盒中的應用。
7、可選的實施方式中，所述lamp擴增反應的目的片段來源于肺炎鏈球菌。
8、第三方面，還提供了一種lamp擴增反應試劑或試劑盒，該試劑或試劑盒包含用于lamp擴增反應的反應組分，所述用于lamp擴增反應的反應組分包含第一方面的bst?dna聚合酶突變體。
9、可選的實施方式中，所述用于lamp擴增反應的反應組分包括所述bst?dna聚合酶突變體、鉀離子、鎂離子、銨離子、表面活性劑、dntps、顏色指示劑和堿；
10、可選的實施方式中，所述試劑或試劑盒包括bst?dna聚合酶突變體0.3～0.75u/μl，kcl?50～100mm，(nh4)2so4?10～20mm，mgso4?8～15mm，tween-20?0.1～0.2％v/v，dntps1.4～3.0mm，酚紅0.05～0.2mm和koh?1.5～2mm。
11、可選的實施方式中，所述用于lamp擴增反應的反應組分為預混試劑2×lamp?mix，其含有0.6～1.5u/μl，kcl?100～200mm，(nh4)2so4?20～40mm，mgso4?16～30mm，tween-200.2～0.4％v/v，dntps?2.8～6.0mm，酚紅0.1～0.4mm和koh?3～4mm。
12、第四方面，還提供了一種肺炎鏈球菌lamp檢測試劑盒，該檢測試劑盒包含第一方面的bst?dna聚合酶突變體和用于lamp擴增的引物組合物；
13、所述引物組合物包括核苷酸序列如seq?id?no.3所示的外引物f3，核苷酸序列如seq?id?no.4所示的外引物b3，核苷酸序列如seq?id?no.5所示的內引物fip，核苷酸序列如seq?id?no.6所示的內引物bip，核苷酸序列如seq?id?no.7所示的環引物loop?f，和核苷酸序列如seq?id?no.8所示的環引物loop?b；
14、可選的實施方式中，外引物f3和外引物b3的濃度分別獨立的為0.2～1.6μm，內引物fip和內引物bip的濃度分別獨立的為0.2～3.2μm，環引物loop?f和環引物loop?b的濃度分別獨立的為0.2～3.2μm。
15、可選的實施方式中，所述的肺炎鏈球菌lamp檢測試劑盒還包括第三方面中的用于lamp擴增反應的反應組分，優選包括所述預混試劑2×lamp?mix。
16、第五方面，還提供了一種非診斷和治療目的的肺炎鏈球菌的檢測方法，所述檢測方法包括采用lamp擴增待測樣本，lamp擴增中使用第一方面的bst?dna聚合酶突變體催化反應。
17、可選的實施方式中，所述lamp擴增的反應時間為10～20min，反應溫度為60～65℃。
18、可選的實施方式中，所述lamp擴增的反應條件為65℃反應15min。
19、可選的實施方式中，所述lamp擴增的反應試劑中含有顏色指示劑，根據反應體系的顏色變化直接裸眼判斷結果。
20、可選的實施方式中，所述lamp擴增中使用第四方面中所述的用于lamp擴增的引物組合物擴增靶基因。
21、可選的實施方式中，使用第四方面的肺炎鏈球菌lamp檢測試劑盒。
22、與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：
23、本專利技術提供的bst?dna聚合酶突變體具有高活性，高產物得率的優點，使用突變后bst?dna聚合酶，可以將lamp擴增反應時間顯著縮短，有效地提高了反應效率。
24、基于bst?dna聚合酶突變體本專利技術還提供本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種Bst?DNA聚合酶突變體，其特征在于，含有如下突變：對應于SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列，存在T186L、G311K、T488E和E557R突變。
2.根據權利要求1所述的Bst?DNA聚合酶突變體，其特征在于，所述Bst?DNA聚合酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
3.權利要求1或2所述的Bst?DNA聚合酶突變體在LAMP擴增反應，或制備用于實現LAMP擴增反應的試劑或試劑盒中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述LAMP擴增反應的目的片段來源于肺炎鏈球菌。
5.一種LAMP擴增反應試劑或試劑盒，其特征在于，包含用于LAMP擴增反應的反應組分，所述用于LAMP擴增反應的反應組分包含權利要求1或2所述的Bst?DNA聚合酶突變體。
6.根據權利要求5所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述用于LAMP擴增反應的反應組分包括所述Bst?DNA聚合酶突變體、鉀離子、鎂離子、銨離子、表面活性劑、dNTPs、顏色指示劑和堿；
7.一種肺炎鏈球菌LAMP檢測試劑盒，其
8.根據權利要求7所述的肺炎鏈球菌LAMP檢測試劑盒，其特征在于，還包括權利要求6中所述的用于LAMP擴增反應的反應組分，優選包括所述預混試劑2×LAMP?mix。
9.一種非診斷和治療目的的肺炎鏈球菌的檢測方法，其特征在于，包括采用LAMP擴增待測樣本，LAMP擴增中使用權利要求1或2所述的Bst?DNA聚合酶突變體催化反應；
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述LAMP擴增的反應試劑中含有顏色指示劑，根據反應體系的顏色變化直接裸眼判斷結果；
...【技術特征摘要】
1.一種bst?dna聚合酶突變體，其特征在于，含有如下突變：對應于seq?id?no.1所示的氨基酸序列，存在t186l、g311k、t488e和e557r突變。
2.根據權利要求1所述的bst?dna聚合酶突變體，其特征在于，所述bst?dna聚合酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
3.權利要求1或2所述的bst?dna聚合酶突變體在lamp擴增反應，或制備用于實現lamp擴增反應的試劑或試劑盒中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述lamp擴增反應的目的片段來源于肺炎鏈球菌。
5.一種lamp擴增反應試劑或試劑盒，其特征在于，包含用于lamp擴增反應的反應組分，所述用于lamp擴增反應的反應組分包含權利要求1或2所述的bst?dna聚合酶突變體。
6.根據權利要求5所述的試劑或試劑盒，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王婷芬，李照廣，王燕萍，
申請(專利權)人：杭州旭科生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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