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    一種蛋白質定量和差異分析方法技術
    
                            
    技術編號：40744095 閱讀：19 留言：0更新日期：2024-03-25 20:02
    
                        
    
                        
    
                            
                            本發明專利技術公開了一種蛋白質定量和差異分析方法，屬于蛋白質分析技術領域，可以實現在遺傳學層面上，可使用反向遺傳學的方法，如knockdown，knockout，CRISPR等，觀察基因改變后導致的表型變化，并結合目的基因回補實驗，進一步證實目的蛋白與表型之間的關聯，且在細胞生物學層面上，一方面可通過敲除目的蛋白或引入目的蛋白的過表達突變體，在表型變化的層面上，觀察目的蛋白表達水平改變或修飾水平的改變對細胞周期、細胞增殖、遷移、極性、凋亡以及細胞間通訊等過程的影響；另一方面可利用免疫熒光、FRET等熒光標記手段對目標分子的亞細胞定位和實時動態變化進行分析，為功能機制的研究和蛋白質相互作用提供依據。
    
                            
                            
    


    
                            

                            
    【技術實現步驟摘要】
    
                                
    本專利技術涉及蛋白質分析，更具體地說，涉及一種蛋白質定量和差異分析方法。

    技術介紹
    1、蛋白質是生物體內最重要的功能分子之一，它們參與了幾乎所有生物過程的調控和執行。蛋白質定量分析是蛋白質組學測序的核心部分，它可以幫助科學家們比較不同樣品中蛋白質的豐度，從而了解不同條件下的蛋白質表達變化。蛋白質差異分析是植物蛋白質組學測序中的重要步驟，它可以比較不同組的蛋白質組成，找出在特定條件下顯著差異表達的蛋白質。
    2、蛋白質定量和差異分析能夠細胞中重要蛋白質的表達變化，優化生物制品的產量與質量。此外，蛋白質組學還有助于篩選出特定蛋白質的變體，提高蛋白質生物活性和穩定性，揭示了植物蛋白質組的復雜性和多樣性，因此研究蛋白質組的定量與差異分析有著重要的意義，為此，本專利技術提出一種蛋白質定量和差異分析方法。

    技術實現思路
    1、1.要解決的技術問題
    2、針對現有技術中存在的問題，本專利技術的目的在于提供一種蛋白質定量和差異分析方法，可以實現在遺傳學層面上，可使用反向遺傳學的方法，如knockdown，knockout，crispr等，觀察基因改變后導致的表型變化，并結合目的基因回補實驗，進一步證實目的蛋白與表型之間的關聯。
    3、2.技術方案
    4、為解決上述問題，本專利技術采用如下的技術方案。
    5、一種蛋白質定量和差異分析方法，包括以下步驟：
    6、s1、首先提取原始樣本中的蛋白質，并將提取的蛋白質在數據庫中進行檢索和比對；
    7、s2、將s1中的蛋白質酶解為肽段，并通過凝膠電泳、質譜等技術獲取肽段的海量數據，并依據這些數據對蛋白質進行鑒定，獲取蛋白質鑒定效果；
    8、s3、根據蛋白質鑒定效果進行蛋白定量分析，并篩選出差異表達蛋白質，對其數量進行統計；
    9、s4、在功能注釋過程中，采用blast2go軟件對所有差異表達蛋白質進行go功能，同時，在go二級功能注釋層級上對差異蛋白數目進行統計，接著進行go功能注釋的顯著性富集分析；
    10、s5、在功能注釋過程中，對顯著性差異表達的蛋白質進行kegg通路注釋，并進行kegg通路富集分析；
    11、s6、然后使軟件wolf?psort對差異蛋白質進行亞細胞定位分析，并采用聚類分析的方法對數據進行分組和歸類；
    12、s7、利用轉錄因子對差異蛋白質進行深入分析，接著通過相互作用網絡分析結果。
    13、進一步的，所述s3中的差異表達蛋白質定義為表達差異倍數大于2倍(上下調)且ttest小于0.05篩選標準的蛋白質。
    14、進一步的，所述s4中利用blast2go對目標蛋白質集合進行go注釋的過程可以歸納為序列比對、go條目提取、go注釋和補充注釋四個步驟。
    15、進一步的，所述s4中差異表達蛋白質的功能富集分析是將所有差異表達蛋白質與實驗鑒定到的所有蛋白質根據go功能的注釋結果進行對照比較，通過fisher富集檢驗，得出兩者差異的顯著性，從而找到所有差異表達蛋白質富集的功能類別。
    16、進一步的，所述s5中的kegg通路注釋為利用koala軟件，首先通過比對kegg?genes數據庫，將目標蛋白質序列進行ko歸類，并根據ko歸類自動獲取目標蛋白質序列參與的通路信息，且kegg通路富集分析采用fisher精確檢驗方法。
    17、進一步的，所述s5中的結構域注釋用的數據庫為interpro數據庫，且差異蛋白結構域注釋結果的富集分析采用fisher精確檢驗方法。
    18、進一步的，所述s6中的聚類分析為采用聚類算法對樣本和變量(在蛋白質組學研究中通常指蛋白質的定量信息)兩個維度進行分類。
    19、進一步的，所述s7中的轉錄因子預測分析常用的數據庫有animaltfdb3.0數據庫和planttfdb5.0數據庫。
    20、進一步的，所述s7中的相互作用網絡分析用的數據庫為string數據庫，所述s7中的相互作用網絡分析用的軟件為anychart軟件。
    21、3.有益效果
    22、相比于現有技術，本專利技術的優點在于：
    23、(1)遺傳學層面：可使用反向遺傳學的方法，如knockdown，knockout，crispr等，觀察基因改變后導致的表型變化，并結合目的基因回補實驗，進一步證實目的蛋白與表型之間的關聯。
    24、(2)生物化學層面：可以考慮對目的蛋白的相互作用蛋白進行分析鑒定，常見的方法是利用目的蛋白的內源性抗體，通過免疫沉淀結合質譜分析的方法鑒定相互作用蛋白；在沒有內源性抗體的情況下，也可考慮采用引入帶有標簽的過表達目的蛋白的pull?down實驗并結合質譜分析的方法鑒定相互作用蛋白，另外可根據目的蛋白的類別(酶，轉錄因子，受體等)設計特定的生物化學實驗。
    25、(3)細胞生物學層面：一方面可通過敲除目的蛋白或引入目的蛋白的過表達突變體，在表型變化的層面上，觀察目的蛋白表達水平改變或修飾水平的改變對細胞周期、細胞增殖、遷移、極性、凋亡以及細胞間通訊等過程的影響；另一方面可利用免疫熒光、fret等熒光標記手段對目標分子的亞細胞定位和實時動態變化進行分析，為功能機制的研究和蛋白質相互作用提供依據。
    26、(4)模式生物實驗層面：如果篩選出的目的蛋白與腫瘤生成密切相關，則可以考慮通過構建基因敲除小鼠、腫瘤異種移植模型、裸鼠成瘤分析等，結合表型分析和生化功能研究，在動物模型中深入探索目的蛋白及相關信號通路在生理病理過程中的意義。
    27、(5)多組學分析：生物活動是一個復雜的過程，由多個生物層面共同參與和決定，其中基因、轉錄、蛋白主要決定生物功能與調控機制，代謝物則是主要的物質來源和表型基礎，對多組學的數據進行聯合分析可以幫助更系統、全面的解析某個生物過程和機制。
    本文檔來自技高網    ...
                            
    
                            
    【技術保護點】
    
                                
    1.一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：包括以下步驟：
    2.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S3中的差異表達蛋白質定義為表達差異倍數大于2倍(上下調)且t?test小于0.05篩選標準的蛋白質。
    3.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S4中利用Blast2GO對目標蛋白質集合進行GO注釋的過程可以歸納為序列比對、GO條目提取、GO注釋和補充注釋四個步驟。
    4.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S4中差異表達蛋白質的功能富集分析是將所有差異表達蛋白質與實驗鑒定到的所有蛋白質根據GO功能的注釋結果進行對照比較，通過Fisher富集檢驗，得出兩者差異的顯著性，從而找到所有差異表達蛋白質富集的功能類別。
    5.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S5中的KEGG通路注釋為利用KOALA軟件，首先通過比對KEGG?GENES數據庫，將目標蛋白質序列進行KO歸類，并根據KO歸類自動獲取目標蛋白質序列參與的通路信息，且KEGG通路富集分析采用Fisher精確檢驗方法。
    6.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S5中的結構域注釋用的數據庫為Interpro數據庫，且差異蛋白結構域注釋結果的富集分析采用Fisher精確檢驗方法。
    7.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S6中的聚類分析為采用聚類算法對樣本和變量(在蛋白質組學研究中通常指蛋白質的定量信息)兩個維度進行分類。
    8.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S7中的轉錄因子預測分析常用的數據庫有AnimalTFDB3.0數據庫和PlantTFDB5.0數據庫。
    9.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述S7中的相互作用網絡分析用的數據庫為String數據庫，所述S7中的相互作用網絡分析用的軟件為AnyChart軟件。
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    【技術特征摘要】
    
                                
    1.一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：包括以下步驟：
    2.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述s3中的差異表達蛋白質定義為表達差異倍數大于2倍(上下調)且t?test小于0.05篩選標準的蛋白質。
    3.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述s4中利用blast2go對目標蛋白質集合進行go注釋的過程可以歸納為序列比對、go條目提取、go注釋和補充注釋四個步驟。
    4.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述s4中差異表達蛋白質的功能富集分析是將所有差異表達蛋白質與實驗鑒定到的所有蛋白質根據go功能的注釋結果進行對照比較，通過fisher富集檢驗，得出兩者差異的顯著性，從而找到所有差異表達蛋白質富集的功能類別。
    5.根據權利要求1所述的一種蛋白質定量和差異分析方法，其特征在于：所述s5中的kegg通路注釋為利用koala軟件，首先通過比對kegg?genes數據庫，...
                            
    
                            
    【專利技術屬性】
    
                                技術研發人員：付萌，張晨，喬洪江，黨二樂，
    
        申請(專利權)人：中國人民解放軍空軍軍醫大學，
    
        類型：發明
    
        國別省市：
    
                            
    
                            
                        
    
                    
    
                    
                    
                     
                
    
                
                
    
                    
    
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