【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基及方法。
技術(shù)介紹
1、類器官(organoid)是一種體外3d培養(yǎng)的能夠形成立體組織結(jié)構(gòu)的生物模型，可以作為多種疾病診療的體外模型，在干細胞與發(fā)育、再生醫(yī)學(xué)、腫瘤精準醫(yī)療、病因病理、藥物開發(fā)等多個方面擁有廣泛的應(yīng)用前景。類器官作為一種新的“模式生物”,由于其組成、結(jié)構(gòu)和功能與體內(nèi)器官非常接近,可為探究人體發(fā)育、疾病發(fā)生機制及篩選高通量藥物等提供一個全新的工具。
2、肝臟是人體重要的代謝調(diào)控中心,參與糖類、脂肪以及氨基酸的合成和分解；作為解毒中心,其能夠降解多種藥物和乙醇等分子；肝臟通過合成并分泌膽鹽和膽汁酸等執(zhí)行外分泌功能。但肝臟可同時受到多種原因包括病毒感染、過量飲酒、炎癥、代謝性因素、遺傳變異和自身免疫改變,以及惡性腫瘤等的損害。肝臟疾病的發(fā)病率及致死率正逐年上升,全世界每年約有200萬人死于肝衰竭。迄今為止,研究肝臟疾病主要依賴于細胞系和動物模型。由于傳統(tǒng)二維(two?dimensional,2d)細胞培養(yǎng)體系的局限性,體外培養(yǎng)的肝實質(zhì)細胞通常缺乏某些肝臟特異性的基因及特定的生物功能,如細胞色素p450的維持、細胞間特定的連接等,尤其是缺乏不同類型細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)間的相互作用,因此,不能很好地重現(xiàn)肝臟細胞的異質(zhì)性及復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征。用于肝臟疾病研究的動物模型優(yōu)于2d培養(yǎng)的細胞,其優(yōu)點包括具有功能性的脈管系統(tǒng)、基質(zhì)和免疫成分,但動物模型的局限性在于其不同的生理、藥物代謝特征以及對遺傳基因變異所致疾病的不同表型。目前主要應(yīng)用的小動物如小鼠和大鼠肝
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)針對目前肝臟類動物模型主要是小動物如小鼠和大鼠肝臟類器官，且形成率低，生長速率慢，應(yīng)用也有局限性，提供一種高效構(gòu)建大型動物如兔源肝臟類器官的方法。
2、本專利技術(shù)首先提供一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基，包括以下組分：wnt3a條件培養(yǎng)基、r-spondin1條件培養(yǎng)基、noggin、hepes、1×glutamax、penicillin/streptomycin、n2細胞培養(yǎng)添加劑、b27細胞培養(yǎng)添加劑、mem非必需氨基酸溶液(neaa)、nicotinamide、n-acetylcystein、a8301、human?egf、human?hgf、human?fgf10、gastrin?1、forskolin、含有y27632的advance?dmem/f12。
3、本專利技術(shù)優(yōu)選的培養(yǎng)基包括以下組分：40-60％(v/v)wnt3a條件培養(yǎng)基、9-11％(v/v)r-spondin1條件培養(yǎng)基、10-30ng/ml?noggin、4-6mmol/ml?hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1-2％(v/v)n2細胞培養(yǎng)添加劑、1-2％(v/v)b27細胞培養(yǎng)添加劑、1-2％(v/v)mem非必需氨基酸溶液(neaa)、1-3mmol/ml?nicotinamide、1-2mmol/ml?n-acetylcystein、4-6umol/mla8301、40-60ng/ml?human?egf、40-60ng/ml?human?hgf、40-60ng/ml?human?fgf10、9-11nmol/ml?gastrin?1、9-11umol/ml?forskolin、含有9-11umol/ml?y27632的advance?dmem/f12。
4、本專利技術(shù)進一步優(yōu)選的培養(yǎng)基包括以下組分：50％(v/v)wnt3a條件培養(yǎng)基、10％(v/v)r-spondin1條件培養(yǎng)基、20ng/ml?noggin、5mmol/ml?hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1％(v/v)n2細胞培養(yǎng)添加劑、1％(v/v)b27細胞培養(yǎng)添加劑、1％(v/v)mem非必需氨基酸溶液(neaa)、2mmol/ml?nicotinamide、1mmol/ml?n-acetylcystein、5umol/mla8301、50ng/ml?human?egf、50ng/ml?human?hgf、50ng/ml?humanfgf10、10nmol/ml?gastrin1、10umol/ml?forskolin、含有10umol/ml?y27632的advancedmem/f12。
5、本專利技術(shù)另外提供一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的方法，包括以下步驟：
6、步驟一：兔源肝臟組織的消化分離：
7、步驟二：兔源肝臟組織類器官的接種培養(yǎng)；
8、步驟三：兔源肝臟組織類器官傳代培養(yǎng)；
9、所述步驟二兔源肝臟組織類器官的接種培養(yǎng)包括以下步驟：
10、1)細胞接種：將分離好的原代細胞中加入advanced?dmem/f12(含1％v/v青霉素-鏈霉素和慶大霉素)培養(yǎng)液，混勻，離心；棄上清，將收集到的細胞/組織沉淀用權(quán)利要求1-3任一所述的兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基重懸后，加入預(yù)制的基質(zhì)膠頂部，使其自然分散得細胞團；
11、2)類器官培養(yǎng)-on-top法：將上述細胞團接種在預(yù)制的基質(zhì)膠中置于37℃、二氧化碳含量5％的環(huán)境中進行培養(yǎng)3-5天，過程中每2-3天進行一次換液，加入培養(yǎng)基時，吸頭朝向側(cè)壁，避免破壞基質(zhì)膠；
12、3)類器官的培養(yǎng)-包埋法：將上述培養(yǎng)的類器官轉(zhuǎn)至膠滴中進行包埋培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)上清，每孔加入3ml?dispase?ii(分散酶ii)，用巴斯德滴管將膠滴吹散，于37℃條件下孵育15-20分鐘，收集懸液，使用1ml吸頭吹打10-20次；4℃、250g條件下離心5分鐘，去上清，向細胞沉淀中加入稀釋的基質(zhì)膠混勻，兔源類器官培養(yǎng)基與基質(zhì)膠的體積比為1:2；按照每滴25-40μl的體積接種至細胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板放置于37℃co2培養(yǎng)箱，加熱30min，待膠體凝固后，將培養(yǎng)板取出，加入預(yù)熱的類器官培養(yǎng)液600μl/孔，周邊孔加入適量的無菌pbs或雙蒸水，減少培養(yǎng)液蒸發(fā)，3-4天更換培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)液時，吸頭朝向側(cè)壁，避免破壞基質(zhì)膠。
13、步驟一兔源肝臟組織的消化分離包括以下步驟：
14、1)組織的清洗：取新鮮的兔源組織，放入離心管中加入10倍體積的pbs搖晃清洗，并棄去上清；
15、2)組織切碎：將清洗后的組織轉(zhuǎn)移到10cm培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀切碎至0.5mm3的小塊；
16、3)組織消化：將組織碎片置于離心管中，加入至少5倍體積的組織消化液，在恒溫搖床中，37℃，200rpm消化處理；邊消化邊觀察，使用短時多次的方法進行消化，具體指每次消化時間控制在3-5分鐘，重復(fù)上述步驟，直至組織大部分消化，僅剩少量的組織碎片；
17、4)細胞收集：通過自然沉降收集上懸液并加入大比例pbs置冰上終止，4℃，300g，離心5分鐘，離心去除上清，收集消化后的本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：Wnt3a條件培養(yǎng)基、R-spondin1條件培養(yǎng)基、Noggin、HEPES、1×GlutaMax、penicillin/streptomycin、N2細胞培養(yǎng)添加劑、B27細胞培養(yǎng)添加劑、MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)、nicotinamide、N-acetylcystein、A8301、human?EGF、human?HGF、human?FGF10、Gastrin?1、Forskolin、含有Y27632的advance?DMEM/F12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：40-60％(V/V)Wnt3a條件培養(yǎng)基、9-11％(V/V)R-spondin1條件培養(yǎng)基、10-30ng/mLNoggin、4-6mmol/mL?HEPES、1×GlutaMax、1×penicillin/streptomycin、1-2％(V/V)N2細胞培養(yǎng)添加劑、1-2％(V/V)B27細胞培養(yǎng)添加劑、1-2％(V/V)MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)、1-
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：50％(V/V)Wnt3a條件培養(yǎng)基、10％(V/V)R-spondin1條件培養(yǎng)基、20ng/mL?Noggin、5mmol/mL?HEPES、1×GlutaMax、1×penicillin/streptomycin、1％(V/V)N2細胞培養(yǎng)添加劑、1％(V/V)B27細胞培養(yǎng)添加劑、1％(V/V)MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)、2mmol/mLnicotinamide、1mmol/mL?N-acetylcystein、5umol/mlA8301、50ng/mL?human?EGF、50ng/mLhuman?HGF、50ng/mL?human?FGF10、10nmol/mL?Gastrin?1、10umol/mL?Forskolin、含有10umol/ml?Y27632的advance?DMEM/F12。
4.一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的方法，其特征在于，步驟一兔源肝臟組織的消化分離包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的方法，其特征在于，所述步驟三兔源肝臟組織類器官傳代培養(yǎng)包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的方法，其特征在于，細胞接種步驟中所述預(yù)制的基質(zhì)膠是將基質(zhì)膠與advance?DMEM/F12按體積比2:1混合，添加至6孔板中，37℃孵育使凝固，形成一層1mm的凝膠層。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：wnt3a條件培養(yǎng)基、r-spondin1條件培養(yǎng)基、noggin、hepes、1×glutamax、penicillin/streptomycin、n2細胞培養(yǎng)添加劑、b27細胞培養(yǎng)添加劑、mem非必需氨基酸溶液(neaa)、nicotinamide、n-acetylcystein、a8301、human?egf、human?hgf、human?fgf10、gastrin?1、forskolin、含有y27632的advance?dmem/f12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效構(gòu)建兔源肝臟類器官的培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：40-60％(v/v)wnt3a條件培養(yǎng)基、9-11％(v/v)r-spondin1條件培養(yǎng)基、10-30ng/mlnoggin、4-6mmol/ml?hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1-2％(v/v)n2細胞培養(yǎng)添加劑、1-2％(v/v)b27細胞培養(yǎng)添加劑、1-2％(v/v)mem非必需氨基酸溶液(neaa)、1-3mmol/ml?nicotinamide、1-2mmol/ml?n-acetylcystein、4-6umol/mla8301、40-60ng/mlhuman?egf、40-60ng/ml?human?hgf、40-60ng/ml?human?fgf10、9-11nmol/ml?gastrin?1、9-11umol/ml?forskolin、含有9-11umol/ml?y27632的advance?dmem/f...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宮曉艷，闞方明，馬曉瑞，王志強，史忠璽，黃璘，
申請(專利權(quán))人：北京嘉士騰醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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