【技術實現步驟摘要】
：本專利技術屬于細胞培養領域，具體涉及一種胎牛血清替代物及其制備方法和應用。
技術介紹
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技術介紹
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1、世界范圍內人口數量的激增及水質富營養化所產生的環境問題，使魚類養殖業正面臨前所有未的挑戰。細胞培養肉作為綜合細胞生物學、生物技術、食品技術的一個全新交叉領域，未來會對可持續肉類生產系統產生巨大影響。細胞培養肉是指在無菌環境下通過組織細胞培養產生的動物肌肉細胞，而不是傳統的動物肌肉食品。細胞培養肉作為一項肉類生產的創新技術主要包括種子細胞提取、細胞擴增、細胞分化及食品化技術，可以大幅提高肉類生產效率。胎牛血清是采取自5-8個月胎齡的牛胚胎中的胎血，其富含細胞生長增殖所需的生長因子、激素、氨基酸及脂質等物質，廣泛應用于細胞培養。傳統細胞培養嚴重依賴胎牛血清培養基，本質上是不可持續的，并暴露出成本昂貴、動物倫理等問題，因此使用更符合人道的低成本胎牛血清替代物成為重要的研發趨勢。
2、肌肉干細胞源于脊椎動物胚胎形成早期的中胚層，一種扁平、有突起的細胞，是骨骼肌再生的必要條件。肌纖維受損后，肌肉干細胞可以快速增殖分化融合形成新的肌纖維。同樣，細胞培養肉在體外選擇性獲取肌肉干細胞后進行快速增殖并誘導分化，促使大量肌肉干細胞融合形成肌纖維。因此需要開發一種適應于大黃魚肌肉干細胞長期增殖的胎牛血清替代物至關重要。
3、目前，領域內雖然有報道相關無血清培養基配方(cn107488625b；cn115896008a；cn104805054b)，但是不同細胞的營養需求、代謝差異等原因導致無血清培養基不具有普適
技術實現思路
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技術實現思路
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1、本專利技術要解決的技術問題是傳統細胞培養嚴重依賴胎牛血清培養基，本質上是不可持續的，并暴露出成本昂貴、動物倫理等問題，需要開發低成本胎牛血清替代物；另外，不同細胞的營養需求、代謝差異等原因導致無血清培養基不具有普適性，目前未見報道適應于大黃魚肌肉干細胞培養的無血清培養基。
2、為解決上述問題，本專利技術經過不斷的實驗和探索，得到了一種胎牛血清替代物，并進一步的將該替代物應用在肌肉干細胞培養的無血清培養中，得到了一種用于大黃魚肌肉干細胞培養的無血清培養基，該培養基可以用于細胞培養肉中。這有效的促進了大黃魚肌肉干細胞在細胞培養肉生產過程中快速增殖和穩定傳代，為細胞培養肉提供了充足的細胞，有利于細胞培養肉產業化生產。
3、為達到上述目的，本專利技術通過以下技術方案實現，一種胎牛血清替代物，包括替代物和添加物；其中替代物為抗凝牛血經進行脫纖維處理后，再經離心、重懸、凍融、濃縮處理，得到的產物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂質、its、人血清白蛋白、胎球蛋白、ultroser?g。所述替代物是一種混合物，是牛血經過離心、重懸凍融、濃縮后的物質；里面主要是蛋白質等營養物質，但單純的替代物不足以支撐細胞的生長，因此本專利技術篩選了一些促進細胞增殖的添加物，由替代物和添加物代替胎牛血清。在添加物中，非必需氨基酸的添加可以顯著降低細胞自身生產非必需氨基酸的副作用；脂質作為細胞膜的結構組分，在信號傳輸過程中起到重要作用。its中包含胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉；胰島素可以促進細胞對葡萄糖和氨基酸的吸收、脂肪的生成并促進細胞增殖；轉鐵蛋白是鐵離子的重要載體；亞硒酸鈉是谷胱甘肽過氧化物酶及其它一些重要酶的輔助因子。人血清白蛋白可以運輸脂肪酸、氨基酸、激素等作用。胎球蛋白是一種血漿糖蛋白，具有促進細胞黏附和生長的作用。ultroser?g是一種包含激素、生長因子、結合蛋白等細胞生長所必須的營養物質。單獨添加以上替代物都不足以支撐細胞增殖，本專利技術經過篩選和實驗得到了可以補足替代物不足的營養的添加物，實現替代物和添加物混合后可以代替胎牛血清促進細胞增殖。
4、進一步的，替代物和添加物按照體積比1：0.01～100的比例混合，優選為1:1；添加物中按體積比添加非必需氨基酸的濃度為0.01％-100％，脂質的濃度為0.01％-100％；its的濃度為0.01％-100％；its中包含胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉，其中，胰島素含量為0.01-100mg/ml，轉鐵蛋白含量為0.01-100mg/ml，亞硒酸鈉含量為0.01-100μg/ml；人血清白蛋白的濃度為0.01-100mg/ml；胎球蛋白的濃度為0.01-1000μg/ml；ultroser?g的濃度為0.01～10％。優選為非必需氨基酸添加1％、脂質添加1％、its添加1％、人血清白蛋白添加1mg/ml、胎牛蛋白添加50μg/ml、ultroserg添加1％。
5、進一步的，所述替代物的制備方法包括以下步驟：
6、(1)收集抗凝牛血進行脫纖維處理：將浸泡氫氧化鈉的玻璃珠加入抗凝牛血中，在4～60℃下，1-3000rpm的轉速下轉動1-120min；其中脫纖維的作用是脫除纖維蛋白原，防止后期配培養基的時候，培養基中的鈣鹽、鎂鹽促使凝血。
7、(2)步驟(1)得到的脫纖維牛血經過離心后取上清液；離心后的沉淀重懸后再次離心，取中層沉淀；將第一次離心的上清液和第二次離心的中層沉淀混合后凍融、濃縮處理，得到胎牛血清替代物。離心是去除血細胞，重懸是將沉淀物重新沖洗一遍，二次離心，最大程度留取初血細胞以外的物質。凍融是將牛血中除了血細胞以后的細胞通過凍融破裂細胞膜，釋放細胞因子。
8、進一步的，步驟(1)抗凝牛血為向無菌牛血內加入抗凝劑的牛血。所述抗凝劑為肝素鈉、edta、枸櫞酸鈉、氯化鈉中的一種或多種；所述無菌牛血為使用無菌針管從牛頸動脈處取血，全程無菌操作得到的牛血。
9、進一步的，步驟(2)中離心步驟的參數為100-10000rpm離心1-120min；再次離心的參數為100-10000rpm離心1-120min。
10、進一步的，步驟(2)中將離心后的沉淀使用1：0.1～10的dhanks液重懸。
11、進一步的，步驟(2)中將混合液于-20～-80℃中反復凍融2～10次。-20℃以下，可以更好的形成冰晶，刺破細胞膜釋放細胞因子。反復凍融2-10次是為了充分刺破細胞膜。
12、進一步的，步驟(2)所述的濃縮為將反復凍融的溶液于40～60℃下旋轉蒸發濃縮。
13、一種上述胎牛血清替代物的制備方法，將替代物和添加物混合后過膜滅菌、包裝即可。優選為過0.22μm濾膜，可以保證無菌。
14、本專利技術得到的胎牛血清替代物顏色呈現淺黃色，澄清透明，其中各組分均為正常市售產品。
15、一種用于大黃魚肌肉干細胞培養的培養基，包括上述胎牛血清替代物和基礎培養基；所述胎牛血清替代物按照體積比1-20％的比例添加至基礎培養基中。優選為按照20％的比例添加至基礎培養基中。
16、進一步的，所述的基礎培養基包括基礎培養基和青霉素-鏈霉素-兩性霉素b溶液，其中基礎培養基為mem培養基、dmem培養基、dmem/f12培養基、f10培養基中的一種或多種組合。優選為dmem/f12培養基，本專利技術本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種胎牛血清替代物，其特征在于：包括替代物和添加物；其中替代物為抗凝牛血經進行脫纖維處理后，再經離心、重懸、凍融、濃縮處理，得到的產物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂質、ITS、人血清白蛋白、胎球蛋白、Ultroser?G。
2.如權利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于：替代物和添加物按照體積比1：0.01～100的比例混合；添加物中按體積比添加非必需氨基酸的濃度為0.01％-100％，脂質的濃度為0.01％-100％；ITS的濃度為0.01％-100％；ITS的濃度為0.01％-100％；人血清白蛋白的濃度為0.01-100mg/mL；胎球蛋白的濃度為0.01-1000μg/mL；Ultroser?G的濃度為0.01～10％。
3.如權利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于所述替代物的制備方法包括以下步驟：
4.如權利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步驟(2)中離心步驟的參數為100-10000rpm離心1-120min；再次離心的參數為100-10000rpm離心1-120min。
5.如權利要求3所述的胎牛血
6.如權利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步驟(2)中將混合液于-20～-80℃中反復凍融2～10次；將反復凍融的溶液于40～60℃下旋轉蒸發濃縮。
7.一種權利要求1所述的胎牛血清替代物的制備方法，其特征在于：將替代物和添加物混合后過膜滅菌、包裝即可。
8.一種用于大黃魚肌肉干細胞培養的培養基，其特征在于：包括權利要求1所述的胎牛血清替代物和基礎培養基，所述胎牛血清替代物按照1-20％的比例添加至基礎培養基中。
9.如權利要求8所述的培養基，其特征在于：所述的基礎培養基包括基礎培養基和青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液，其中基礎培養基為MEM培養基、DMEM培養基、DMEM/F12培養基、F10培養基中的一種或多種組合。
10.權利要求8所述的培養基在細胞培養肉中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種胎牛血清替代物，其特征在于：包括替代物和添加物；其中替代物為抗凝牛血經進行脫纖維處理后，再經離心、重懸、凍融、濃縮處理，得到的產物；所述添加物包括非必需氨基酸、脂質、its、人血清白蛋白、胎球蛋白、ultroser?g。
2.如權利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于：替代物和添加物按照體積比1：0.01～100的比例混合；添加物中按體積比添加非必需氨基酸的濃度為0.01％-100％，脂質的濃度為0.01％-100％；its的濃度為0.01％-100％；its的濃度為0.01％-100％；人血清白蛋白的濃度為0.01-100mg/ml；胎球蛋白的濃度為0.01-1000μg/ml；ultroser?g的濃度為0.01～10％。
3.如權利要求1所述的胎牛血清替代物，其特征在于所述替代物的制備方法包括以下步驟：
4.如權利要求3所述的胎牛血清替代物，其特征在于：步驟(2)中離心步驟的參數為100-10000rpm離心1-120min；再次離心的參數為100-1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：薛長湖，殷浩文，鄭洪偉，楊魯，閆曉萌，
申請(專利權)人：中國海洋大學，
類型：發明
國別省市：
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