【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及煙草多酚氧化酶ntppo5及其編碼基因、重組表達載體和應用，屬于植物基因工程。
技術介紹
1、多酚氧化酶(polyphenol?oxidase，ppo)是一種銅結合酶，廣泛存在于植物、動物和微生物中。根據其底物的特異和作用機制，可分為三類：酪氨酸酶(ec?1.14.18.1)、兒茶酚氧化酶(ec?1.10.3.1)和漆酶(ec?1.10.3.2)。多酚氧化酶在生物體內具有多種功能。ppo參與了植物的生長和發育過程，如花朵開放、果實成熟和葉片的黃化等。ppo能將植物中多酚類物質(如酪酸、兒茶酚等)轉化為具有較高活性的氧化產物，如喹啉、喹啉醇等，這種氧化反應通常以分子氧為底物，產生的氧化產物具有多種生物活性，包括抗氧化、抗菌和抗腫瘤等。另外多酚底物被ppo氧化，被認為是許多水果和蔬菜在收獲、儲存、運輸和加工過程中棕色變色的主要原因，因此抑制多酚氧化酶的活性可以提高食品的保鮮性和品質。多酚氧化酶還可以應用于環境保護領域，它能夠催化工業廢水和水體中有機物的氧化降解，從而減少水體污染。此外，多酚氧化酶還可以用于處理農藥和有機污染物的土壤和廢物。由于多酚氧化酶應用領域逐漸擴大，人們對多酚氧化酶的研究也越來越深入。
2、植物中的多酚氧化酶基因不僅功能復雜，而且多以基因家族的形式存在。目前研究者們在馬鈴薯、番茄、玉米、大豆、丹參、煙草等植物中均鑒定出多個多酚氧化酶，其中，根據普通煙草基因組數據庫中序列同源性分析表明，煙草中多酚氧化酶基因可能有12～14個。申請公布號為cn110846431a中國專利技術專利公開了煙草多
技術實現思路
1、本專利技術的第一個目的是提供煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5，以解決現有技術中煙草多酚氧化酶基因家族有部分成員未知的問題。
2、本專利技術的第二個目的是提供煙草多酚氧化酶ntppo5，以解決現有技術中煙草多酚氧化酶家族有部分成員未知的問題。
3、本專利技術的第三個目的是提供重組表達載體，以解決現有技術中對煙草多酚氧化酶基因家族研究不夠深入，而導致存在多酚氧化酶基因功能在煙草中未知的問題。
4、本專利技術的第四個目的是提供煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5或重組表達載體在煙草多酚類物質含量調控中的應用，以解決現有技術中對煙草多酚氧化酶基因家族研究不夠深入，而導致存在多酚氧化酶基因功能在煙草中未知的問題。
5、本專利技術的第五個目的是提供煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5或重組表達載體在煙草植株表型優化中的應用，以解決現有技術中對煙草多酚氧化酶基因家族研究不夠深入，而導致存在多酚氧化酶基因功能在煙草中未知的問題。
6、為了實現上述目的，本專利技術煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5所采用的技術方案是：
7、煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5，其核苷酸序列為：
8、(1)seq?id?no.1所示的核苷酸序列；
9、或(2)seq?id?no.1所示的核苷酸序列經取代和/或缺失和/或添加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白的核苷酸序列。
10、上述技術方案的有益效果在于：本專利技術在前期研究的基礎上，以普通煙草不同時期葉片的cdna為模板，利用pcr技術，克隆獲得了煙草多酚氧化酶的同源基因，命名為ntppo5。本專利技術通過對ntppo5基因的克隆和表達載體的構建與分析發現，在煙草植株中過表達該基因能顯著提高葉片中多酚氧化酶的活性。本專利技術發現的煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5基因，豐富了煙草多酚氧化酶基因家族，為研究煙草中多酚氧化酶的功能奠定基礎。
11、為了實現上述目的，本專利技術煙草多酚氧化酶ntppo5所采用的技術方案是：
12、煙草多酚氧化酶ntppo5，其氨基酸序列為：
13、(1)seq?id?no.2所示的氨基酸序列；
14、或(2)seq?id?no.2所示的氨基酸序列經取代和/或缺失和/或添加一個或多個氨基酸殘基且功能相同的衍生蛋白。
15、上述技術方案的有益效果在于：本專利技術通過實驗證明，在煙草植株中過表達煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5能顯著提高葉片中多酚氧化酶的活性。
16、為了實現上述目的，本專利技術重組表達載體所采用的技術方案是：
17、重組表達載體，所述重組表達載體包含所述的煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5。
18、上述技術方案的有益效果在于：利用基因工程的手段，將ntppo5基因插入到pcambia1300出發載體上，構建過表達ntppo5基因的重組表達載體，轉化煙草后，顯著提高ntppo5基因的表達量，為后續該基因功能的研究提供良好的工具。
19、為了實現上述目的，本專利技術煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5或重組表達載體在煙草多酚類物質含量調控中的應用所采用的技術方案是：
20、煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5或重組表達載體在煙草多酚氧化酶含量調控中的應用，所述多酚類物質包括綠原酸和蘆丁。
21、上述技術方案的有益效果在于：本專利技術通過基因工程手段，構建重組表達載體，轉入煙草中，過表達ntppo5基因，獲得ntppo5基因過表達煙草植株，檢測發現所得ntppo5基因煙草植株葉片中多酚氧化酶的活性顯著增加；與正常對照組相比，ntppo5基因過表達煙草植株成熟期葉片中多酚類物質綠原酸和蘆丁含量顯著降低。本專利技術豐富了煙草中多酚氧化酶體系，為煙草中多酚氧化酶功能的研究提供新的研究對象。
22、作為進一步地改進，過表達ntppo5基因，煙草中綠原酸和蘆丁的含量降低。
23、為了實現上述目的，本專利技術煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5或重組表達載體在煙草植株表型優化中的應用所采用的技術方案是：
24、煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5或重組表達載體在煙草植株表型優化中的應用。
25、上述技術方案的有益效果在于：本專利技術通過構建ntppo5基因過表達的煙草植株，經觀察發現ntppo5基因過表達后，煙草植株節距增加、總葉片和花蕾數減少。而煙草葉片較大，株高較高，造成其下部葉片透光性不是很良好，同時由于煙草葉片開片較大，也會影響煙田的通風情況。目前針對煙草株型尤其是節間性狀育種的研究還比較少，而本專利技術證明ntppo5基因能調控煙草植物的節距、葉片數，這為通過改善煙草的節間長度進而改善煙草的透光性、通風性，最終提高煙草的光合利用率及煙草的總產量提供了一個重要的研究方向，為煙葉品質改善、煙草品種遺傳改良提供遺傳材料和理論依據。
26、作為進一步地改進，過表達nt本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.煙草多酚氧化酶編碼基因NtPPO5，其特征在于：其核苷酸序列為：
2.煙草多酚氧化酶NtPPO5，其特征在于：其氨基酸序列為：
3.重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體包含權利要求1所述的煙草多酚氧化酶編碼基因NtPPO5。
4.一種如權利要求1所述的煙草多酚氧化酶編碼基因NtPPO5或權利要求3所述的重組表達載體在煙草多酚類物質含量調控中的應用，其特征在于：所述多酚類物質包括綠原酸和蘆丁。
5.根據權利要求4所述的煙草多酚氧化酶編碼基因NtPPO5或重組表達載體在煙草多酚類物質含量調控中的應用，其特征在于：過表達NtPPO5基因，煙草中綠原酸和蘆丁的含量降低。
6.一種如權利要求1所述的煙草多酚氧化酶編碼基因NtPPO5或權利要求3所述的重組表達載體在煙草植株表型優化中的應用。
7.根據權利要求6所述的煙草多酚氧化酶編碼基因NtPPO5或重組表達載體在煙草植株表型優化中的應用，其特征在于：過表達NtPPO5基因，煙草植株節距增加、總葉片和花蕾數減少。
【技術特征摘要】
1.煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5，其特征在于：其核苷酸序列為：
2.煙草多酚氧化酶ntppo5，其特征在于：其氨基酸序列為：
3.重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體包含權利要求1所述的煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5。
4.一種如權利要求1所述的煙草多酚氧化酶編碼基因ntppo5或權利要求3所述的重組表達載體在煙草多酚類物質含量調控中的應用，其特征在于：所述多酚類物質包括綠原酸和蘆丁。
5.根據權利要求4所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：武明珠，夏琳，楊軍，李亦君，謝小東，王中，羅朝鵬，李鋒，
申請(專利權)人：中國煙草總公司鄭州煙草研究院，
類型：發明
國別省市：
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