【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)，涉及病毒檢測，具體涉及一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合、試劑盒及檢測方法。
技術(shù)介紹
1、人腺病毒(human?adenovirus，hadv)是一種具有高度傳播能力的dna病毒，其結(jié)構(gòu)為無包膜，病毒衣殼呈現(xiàn)二十面體對稱形態(tài)。自1953年，rowe等從健康人萎縮的扁桃體腺樣組織中首次提取出hadv以來，其一直受到傳染病和流行病學(xué)界的關(guān)注。據(jù)報道，現(xiàn)被發(fā)現(xiàn)的人腺病毒分為a-g七個亞屬，根據(jù)它們自身的生物學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)、生物分子和遺傳及生化的特征，被劃分為113個型別。在七個類別不同的亞屬中，致病性腺病毒以呼吸道腺病毒最為常見，其中與呼吸道腺病毒有關(guān)的是b(hadv-3、7、11、14、16、21、50、55)、c(hadv-1、2、5、6、57)和e(hadv-4)三個亞屬，這些病毒都會引起上呼吸道感染、下呼吸道感染、支氣管炎等呼吸道疾病，有些病例還會伴隨胃腸道癥狀如腹瀉、嘔吐、腹痛等，多數(shù)患者為輕微的自限性感染，但嚴(yán)重者也會導(dǎo)致肺炎。
2、目前我國共報道了17種涉及呼吸道腺病毒感染的病毒類型，其中hadv-55、hadv-7和hadv-3是暴發(fā)事件中的主要致病基因分型，另外還有hadv-4、hadv-14、hadv-16型、hadv-21型等也在多次的大規(guī)模感染中被檢測到。
3、當(dāng)前呼吸道腺病毒檢測方法主要為基于pcr技術(shù)，其以靈敏、快捷等優(yōu)勢得到極大的發(fā)展。其中多重實(shí)時熒光pcr技術(shù)因具有高度的特異性和敏感性，并且具有全封閉擴(kuò)增、簡便快捷、重復(fù)性好、實(shí)時檢測等優(yōu)勢，成為腺病毒分
4、因此，如何快速檢測和鑒別呼吸道腺病毒多個主要的分型，仍是亟需解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對上述提出的如何快速檢測和鑒別呼吸道腺病毒多個主要的分型，本專利技術(shù)提供一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合、試劑盒及檢測方法，針對人腺病毒b亞屬和e亞屬的相關(guān)腺病毒分型進(jìn)行設(shè)計引物，并配合合適的探針進(jìn)行檢測，同時建立多重實(shí)時熒光pcr檢測試劑盒，實(shí)現(xiàn)呼吸道腺病毒多個主要的分型的快速精準(zhǔn)鑒別。具體技術(shù)方案如下：
2、首先，本專利技術(shù)提供一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，包括八組引物對和八個探針，各引物及探針的核苷酸序列如seq?no.1～seq?no.24所示。
3、前述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，其中，
4、seq?no.1～seq?no.3所示的引物對和探針用于檢測hadv-3型；
5、seq?no.4～seq?no.6所示的引物對和探針用于檢測hadv-4型；
6、seq?no.7～seq?no.9所示的引物對和探針用于檢測hadv-7型；
7、seq?no.10～seq?no.12所示的引物對和探針用于檢測hadv-16型；
8、seq?no.13～seq?no.15所示的引物對和探針用于檢測hadv-21型；
9、seq?no.16～seq?no.18所示的引物對和探針用于檢測hadv-14型；
10、seq?no.19～seq?no.21所示的引物對和探針用于檢測hadv-55型的靶點(diǎn)1；
11、seq?no.22～seq?no.24所示的引物對和探針用于檢測hadv-55型的靶點(diǎn)2。
12、前述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，所述hadv-55型的靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2分別為其penton基因何和poly基因。
13、其次，本專利技術(shù)提供一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，包括反應(yīng)混合液a，反應(yīng)混合液b，反應(yīng)混合液c，熱啟動dna聚合酶，hadv陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；
14、所述反應(yīng)混合液a，反應(yīng)混合液b，反應(yīng)混合液c中均含有反應(yīng)緩沖液、mg2+以及三磷酸脫氧核苷酸混合物；
15、并且各反應(yīng)混合液中還含有不同的權(quán)利要求1-3任意一項所述的引物和探針中的一組或多組。
16、前述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒中，
17、所述反應(yīng)混合液a含有用于檢測hadv-3型、hadv-4型和hadv-7型的引物和探針；
18、反應(yīng)混合液b含有用于檢測hadv-16型、hadv-21型和hadv-14型的引物和探針；
19、反應(yīng)混合液c含有用于檢測hadv-55型的靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2的引物和探針。
20、前述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，所述hadv陽性質(zhì)控品為含腺病毒各分型檢測靶序列的重組質(zhì)粒；其濃度分別為：
21、hadv-3：2.42e+06copies/ml，
22、hadv-4：1.91e+06copies/ml，
23、hadv-7：2.07e+06copies/ml，
24、hadv-16：1.88e+06copies/ml，
25、hadv-21：1.59e+06copies/ml，
26、hadv-14：2.77e+06copies/ml，
27、hadv-55：1.38e+06copies/ml；
28、所述陰性質(zhì)控品為不含rnase和dnase的純化水；
29、該試劑盒對腺病毒各分型的檢測下限為500copies/ml。
30、前述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，該試劑盒存儲條件為-20℃，且反復(fù)凍融次數(shù)不超過5次。
31、再次，本專利技術(shù)提供一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測方法，使用前所述的試劑盒進(jìn)行檢測；使用該試劑盒檢測選用的pcr反應(yīng)體系為25μl，包括20μl的反應(yīng)混合液a或反應(yīng)混合液b或反應(yīng)混合液c和5μl的待檢測的核酸樣品。
32、前述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測方法，所述反應(yīng)混合液a、反應(yīng)混合液b、反應(yīng)混合液c的組分具體包括：2×one?step?rt-qpcr?probe?buffer?iv?12.5μl；各引物和探針0.37～0.58μl；dna聚合酶0.5μl；余量為滅菌水。
33、前述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測方法，該檢測的反應(yīng)條件為：預(yù)變性階段：預(yù)變性階段：94℃，2min；擴(kuò)增階段：變性94℃，10sec；退火56℃，50sec；共40個循環(huán)；在退火步驟檢測熒光信號。
34、本專利技術(shù)具備的有益效果如下：
35、1)本專利技術(shù)結(jié)合呼吸道腺病毒流行病學(xué)研究，針對人腺病毒b亞屬和e亞屬的腺病毒分型設(shè)計了特異性引物和熒光標(biāo)記探針，同時檢測呼吸道腺病毒的多個主要分型核酸，實(shí)現(xiàn)呼吸道腺病毒多個主要的分型的快本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，其特征在于：包括八組引物對和八個探針，各引物及探針的核苷酸序列如SEQ?NO.1～SEQ?NO.24所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，其特征在于：其中，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，其特征在于：所述HAdV-55型的靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2分別為其penton基因和poly基因。
4.一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，其特征在于：包括反應(yīng)混合液A，反應(yīng)混合液B，反應(yīng)混合液C，熱啟動DNA聚合酶，HAdV陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，其特征在于：
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述HAdV陽性質(zhì)控品為含腺病毒各分型檢測靶序列的重組質(zhì)粒；其濃度分別為：
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒存儲條件為-20℃，且反復(fù)凍融次數(shù)不超過5次。
8.一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測方法，其特
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測方法，其特征在于：所述反應(yīng)混合液A、反應(yīng)混合液B、反應(yīng)混合液C的組分具體包括：
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測方法，其特征在于：該檢測的反應(yīng)條件為：預(yù)變性階段：預(yù)變性階段：94℃，2min；擴(kuò)增階段：變性94℃，10sec；退火56℃，50sec共40個循環(huán)；在退火步驟檢測熒光信號。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，其特征在于：包括八組引物對和八個探針，各引物及探針的核苷酸序列如seq?no.1～seq?no.24所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，其特征在于：其中，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測引物組合，其特征在于：所述hadv-55型的靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2分別為其penton基因和poly基因。
4.一種呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，其特征在于：包括反應(yīng)混合液a，反應(yīng)混合液b，反應(yīng)混合液c，熱啟動dna聚合酶，hadv陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，其特征在于：
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述hadv陽性質(zhì)控品為含腺病毒各分型檢測靶序列的重...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丁小靜，張倩，楊揚(yáng)，戴舒雅，
申請(專利權(quán))人：江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。