富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制備方法技術

本發明專利技術涉及富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制備方法。它是以酪蛋白為原料，采用蛋白水解酶進行適度水解，水解度控制在１０％以內，沸水浴加熱滅酶，采用５ｋＤａ超濾膜從反應體系中分離出各種產物多肽，再將該產物用１ｋＤａ的超濾膜進行截留，所得截留液采用鈣－乙醇選擇性沉淀磷酸肽，再將其用去離子水或揮發性鹽溶液溶解，上樣到強陽離子交換柱上，分離獲得帶多個磷酸化的多肽。采用噴霧干燥或冷凍干燥獲得產品。最后采用液質聯用對所得磷酸肽進行序列鑒定。本發明專利技術可選擇性地獲得具有更高活性的磷酸肽，在食品生物技術領域中具有良好的應用前景，并為磷酸蛋白質組學的研究提供很好的研究樣品。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種，這些磷酸肽大多 攜帶SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列片段，屬于食品生物

技術介紹
酪蛋白約占哺乳動物乳品中蛋白質總量的80%，是由asl-酪蛋白、aS2-酪蛋白、 β-酪蛋白、κ-酪蛋白等四種磷酸化蛋白質聚集而成的膠束大分子。當新生兒喂食母乳 后，酪蛋白膠束作為磷酸鈣膠體的運輸者，為孩子的骨骼形成和牙齒生長提供必要的礦物 質元素。母乳在體內消化過程中，酪蛋白將被水解為各種各樣的多肽，但它結合金屬的功能 將由水解物-酪蛋白磷酸肽(CPPs)保留甚至加強。目前，大量實驗和臨床數據顯示，CPPs可 對人體營養系統提供多種生物學功能，如抗氧化、抗齲齒、免疫調節和補充礦物質元素(如 鈣、鐵、鋅)。酪蛋白磷酸肽在蛋白序列中是無活性的，只有在食品加工或體內消化后從序列中 釋放時才能發揮其各種生物學功能。迄今為止，為了制備CPPs，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 血漿酶、Lactobacillus蛋白酶和胰酶等對酪蛋白、酪蛋白酸鈉或脫脂牛乳的水解作用已被 廣泛研究。然而，這些研究大多限于水解產物中各種磷酸肽的制備，而未區分多磷酸化多肽 和單磷酸化多肽。其中，如果CPPs含有SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列，帶有多個磷酸化基 團，其攜帶礦物質元素能力較強。此外，多磷酸化多肽的制備還可為研究磷酸化蛋白質組學提供很好的樣品。在蛋 白質組學中，微量的磷酸化蛋白序列鑒定與結構分析仍存在巨大挑戰。蛋白質的可逆磷酸 化是最常見且最重要的翻譯后修飾之一，幾乎參與了生命活動的所有過程，包括細胞的增 殖、發育和分化、肌肉收縮、新陳代謝等。此外，許多糖尿病、老年癡呆等疑難疾病的發生， 也與蛋白質的可逆磷酸化密切相關。利用規模制備好的多磷酸多肽，可較好地解析磷酸化 (尤其是多個磷酸化)對蛋白質質譜行為的影響規律。目前，研究者報道了酪蛋白磷酸肽的分離純化，但有些未能對其序列結構進行解 析，有些是制備各種類型磷酸肽。為了制備多磷酸化的CPPs，需整合多種分離方式，并對最 終產品進行測定。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種。根據多 磷酸化多肽的結構特點。多磷酸化CPPs分子量大多超過lkDa，且攜帶多個負電荷。由于其 分子量較大，一般出現在水解初期，因此酪蛋白水解需控制在低水解度范圍內。再采用5kDa 超濾膜將產物多肽從反應體系中分離出來，截留酶和未反應的底物，并用IkDa去除小分子 量多肽，再利用鈣_乙醇沉淀法獲得磷酸肽，最后采用強陽離子交換層析進行分級，經過質 譜鑒定與Sequest數據庫檢索確定磷酸肽序列。基于該工藝，可獲得帶有多個磷酸化基團 的多肽，具有很好的抗齲齒、免疫調節和補充礦物質元素等生物學功能，并為磷酸蛋白質組4學提供質譜或機理分析的樣品。本專利技術目的是提供一種富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物是以酪蛋白為原料，采 用蛋白水解酶進行適度水解，水解度需控制10%以內，沸水浴加熱滅酶，采用5kDa超濾膜 從反應體系中分離出各種產物多肽，再將該產物用IkDa的超濾膜進行截留，所得截留液采 用鈣_乙醇選擇性沉淀磷酸肽，再將其用去離子水或揮發性鹽溶液溶解，上樣到強陽離子 交換柱上，分離獲得帶多個磷酸化的多肽，采用噴霧干燥或冷凍干燥獲得產品。所述的多肽均含有多個磷酸化基團，共檢出9個多磷酸化多肽(占水解產物中所 有磷酸肽的30% )，每個多肽所帶磷酸化基團至少4個。本專利技術的富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物的制備方法包括的步驟1)酪蛋白的溶解將酪蛋白溶解在指定pH(7.0_9.0)的堿性溶液中，配制成 10-30g/L的蛋白溶液，滴加堿或者酸調節到指定pH值。2)酶解將蛋白溶液置于持續攪拌且恒溫30-40°C的反應器中，按照酶與底物的 質量比為1 (10-1000)加入蛋白水解酶，開始反應并計時。控制反應體系的水解度小于 10%，停止反應，沸水浴滅酶。3)5kDa超濾膜分離將步驟2)獲得的酶解液置于5kDa膜分離裝置中，通過膜過 濾截留分子量較大的底物和蛋白酶，得到低于5kDa分子量的水解產物。4) IkDa超濾膜分離將步驟3)獲得的水解產物置于IkDa膜分離裝置中進行過 濾，獲得分子量l_5kDa的截留液。5)鈣-乙醇選擇性沉淀磷酸肽在步驟4)獲得的分子量大于IkDa的截留液中， 加入0. 8-1. 2%的CaCl2,靜置45 60min,使Ca2+與CPPs產品中的磷酸基團充分結合，再 加入乙醇，使乙醇濃度為40-80%，形成沉淀，將其離心后取沉淀。6)離子交換層析制備多磷酸化的多肽將步驟5)獲得的沉淀物，用去離子水或揮 發性鹽溶液溶解，在強陽離子交換層析系統中上樣，收集各個洗脫時間的組分。洗脫條件 流動相A為IOmM檸檬酸緩沖液，pH 3. 0 ；流動相B為IOmM檸檬酸緩沖液，lmol/LNaCl, pH 3. 0 ；梯度條件為 100% A(0 7. 5mL)，100% A 45% A(7. 5 37. 5mL), 100% B(37. 5 48mL)；上樣流速為lmL/min ；洗脫流速為lmL/min。其中，最先洗脫的組分即為帶多磷酸化 基團的多肽。7)干燥將步驟6)獲得的多磷酸化多肽進行收集，將其噴霧干燥或冷凍干燥，獲得廣品。8)磷酸肽的序列鑒定將步驟6)_7)獲得的樣品溶于0. 三氟乙酸溶液中，采用 液質聯用技術和Sequest數據庫檢索對活性肽的序列進行鑒定。所述的蛋白水解酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶等。所述步驟3)和4)的超濾膜包括中空纖維膜、平板膜、卷式膜等。本專利技術提供的帶多個磷酸化基團的多肽制備方法，可選擇性地獲得具有更高活性 的磷酸肽，在食品生物
中具有良好的應用前景，并為磷酸蛋白質組學的研究提供 很好的研究樣品。附圖說明圖1多磷酸化的酪源多肽制備的工藝流程圖。圖2強陽離子交換層析分級制備多磷酸化多肽的色譜圖。具體實施例方式實施例1配置lL20g/L的牛乳酪蛋白(Sigma公司)溶液，調節pH值為8. 0，將其置于持續 攪拌且恒溫37°C的反應器中。按照酶與底物質量比為1 100加入0.2g胰酶(Sigma公 司)，并開始計時，同時滴加NaOH維持體系pH值為8. 0。反應IOmin后停止反應，立即沸水 浴滅酶lOmin，此時水解度為6%。利用5kDa的中空纖維膜對酶解液進行過濾，獲得濾出液 (產物)，再利用IkDa的中空纖維膜進行過濾，獲得分子量為lk_5kDa的截留液。在截留液 中加入CaCl2,使其濃度為1. 0%，靜置60min，再加入乙醇，使乙醇濃度為60%，形成沉淀， 將其離心(IOOOOrpm)后取沉淀。將沉淀產物用去離子水溶解，取30mL上樣到強陽離子交換層析柱SP650M(T0S0H 公司)，進行梯度洗脫，洗脫條件流動相A為IOmM檸檬酸緩沖液，pH 3. O ；流動相B為 IOmM檸檬酸緩沖液，lmol/LNaCl，pH 3. O ；梯度條件為 100% A(O 7. 5mL)，100% A 45% A(7. 5 37. 5mL)，100% B(37. 5 48mL)；上樣流速為 lmL/min ；洗脫流速為 lmL/min。經 過洗脫，獲得5個組分(圖2)。再對所獲得的5個組分進行本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物，其特征在于它是以酪蛋白為原料，采用蛋白水解酶進行適度水解，水解度需控制１０％以內，沸水浴加熱滅酶，采用５ｋＤａ超濾膜從反應體系中分離出各種產物多肽，再將該產物用１ｋＤａ的超濾膜進行截留，所得截留液采用鈣－乙醇選擇性沉淀磷酸肽，再將其用去離子水或揮發性鹽溶液溶解，上樣到強陽離子交換柱上，分離獲得帶多個磷酸化的多肽，采用噴霧干燥或冷凍干燥獲得產品。

【技術特征摘要】
一種富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物，其特征在于它是以酪蛋白為原料，采用蛋白水解酶進行適度水解，水解度需控制10％以內，沸水浴加熱滅酶，采用5kDa超濾膜從反應體系中分離出各種產物多肽，再將該產物用1kDa的超濾膜進行截留，所得截留液采用鈣 乙醇選擇性沉淀磷酸肽，再將其用去離子水或揮發性鹽溶液溶解，上樣到強陽離子交換柱上，分離獲得帶多個磷酸化的多肽，采用噴霧干燥或冷凍干燥獲得產品。2.根據權利要求1所述的酪蛋白水解物，其特征在于所述的多肽均含有多個磷酸化基 團，共檢出9個多磷酸化多肽，占水解產物中所有磷酸肽的30%，每個多肽所帶磷酸化基團 至少4個。3.根據權利要求1所述的酪蛋白水解物，其特征在于所述的多肽的組成與氨基酸序列α S160-98(5P)Met-Glu-Ala-Glu-SerP-Ile-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-IIe-Val-Pro-A sn-SerP-Val-Glu-Gln-Lys-His-IIe-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu α S21-19 (4P) Lys-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Il e-SerP-Gln-Glu-Thrα S2l-20 (4P) Lys-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Il e-SerP-Gln-Glu-Thr-Tyrα S2l-24(4P) Lys-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Il e-SerP-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys-G In-Glu-Lysβ 1-24(4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thrβ 1-25 (4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Argβ 1-28(4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lysβ 1-29 (4P) Arg-Glu-Leu-G...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蘇榮欣，齊崴，何志敏，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：12[中國|天津]