【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于電化學檢測，涉及一種納米孔檢測丁肝病毒抗原的方法。
技術介紹
1、1970年，意大利都靈學者在嚴重的慢性乙型肝炎患者中發現了一種新型免疫產物。1977年，該產物被命名為δ因子，被rizzetto等學者第一次正式報道。1978年，美國國立衛生研究院開始進行相關研究，發現δ因子與一種新型病毒顆粒相關。1980年，該病毒顆粒被正式命名為丁型肝炎病毒(hepatitis?d?virus，hdv)。hdv被發現是一種有缺陷的單股負鏈rna病毒，必需依賴乙型肝炎病毒(hepatitis?b?virus，hbv)等嗜肝dna病毒為其提供外殼，才能進行復制。hdv存在于乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)陽性的hdv感染者的肝細胞核內和血清中，主要在肝細胞內復制。hdv主要通過輸血和血制品傳播，與hbv的傳播方式相似，hdv感染大多見于hbv感染者，也可見散發性hdv感染者。hdv與hbv重疊感染后，可促使肝損害加重，并易發展為慢性活動性肝炎、肝硬化和重型肝炎。
2、目前對于丁型肝炎病毒檢測在臨床上有多種檢測方法，較常見的方法有肝功能檢查、hdv?rna檢查、hdv抗體(-ab)、elisa方法檢測hdv抗原(-ag)等方法。但肝功能檢查時只能做肝臟有無病毒感染的排除法，無法一次性檢測患有某型肝炎病毒；hdv?rna檢測由于其基因組高度可變性，給引物的設計帶來了巨大的挑戰，目前尚無統一的檢測標準；hdv抗體檢測主要是針對hdv-igg進行，但hdv-igg與肝細胞受損和炎癥活動密切相關，在急性感染與慢性感染中常會出現結果
3、鑒于以上，迫切的需要一種高選擇性、高靈敏度、高特異性的檢測方法來對丁型肝炎病毒中的抗原進行檢測。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種納米孔檢測丁肝病毒抗原的方法。
2、為達到上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、一種納米孔檢測丁肝病毒抗原的方法，所述方法具體如下：
4、將納米孔放置在電化學檢測裝置中形成納米孔電化學檢測裝置，在納米孔電化學檢測裝置中加入電解液，將待測樣品溶液置于納米孔的順式側(cis端)，施加外電場，采集所述樣品的電流信號，對電流信號的幅值、阻滯時間、信號頻率特征進行分析，從而在單分子層面或細胞層面檢測丁型肝炎抗原。所述樣品包括丁肝病毒抗原蛋白、丁肝病毒抗原質粒轉染細胞裂解液、丁肝病毒感染細胞裂解液。丁型肝炎病毒抗原包括丁型肝炎病毒大抗原和丁型肝炎病毒小抗原，丁型肝炎病毒大抗原的序列為：
5、msrsesrknrggreeileqwvagrkkleelerdlrktkkklkkiedenpwlgnikgilgkk
6、dkdgegappakrartdqmevdsgpgkrplrggftdkerqdhrrrkalenkkkqlsaggk
7、nlskeeeeelrrlteederrerrvagppvggvnpleggsrgapgggfvpnlqgvpespfsrtgegldirgnqgfpwdilfpadppfspqscrpqhhhhhh，如seq?id?no:1所示。
8、丁型肝炎病毒小抗原的序列為：
9、msrsesrknrggreeileqwvagrkkleelerdlrktkkklkkiedenpwlgnikgilgkkdkdgegappakrartdqmevdsgpgkrplrggftdkerqdhrrrkalenkkkqlsaggknlskeeeeelrrlteederrerrvagppvggvnpleggsrgapgggfvpnlqgvpespfsrtgegldirgnqgfphhhhhh，如seq?id?no:2所示。
10、優選的，所述納米孔電化學檢測裝置構建如下：
11、將嵌有納米孔的支撐薄膜放置在兩個含有電解質的溶液腔室之間，在兩個溶液腔室之間構建電流回路，具體的，將兩個電極分別置于兩個溶液腔室中，兩個電極之間依次連接電源、電流表等裝置，形成電流回路，即可形成所述納米孔電化學檢測裝置。
12、所述支撐薄膜為特氟龍膜。
13、所述腔室材料為樹脂。
14、所述納米孔為mspa生物納米孔。
15、所述電極為表面涂覆有氯化銀的銀電極。
16、進一步優選的，所述溶液腔室中的電解液為1-丁基-3-甲基咪唑氯化物(bmimcl)和三羥甲基氨基甲烷(tris)溶于水形成的混合溶液；
17、所述電解液中1-丁基-3-甲基咪唑氯化物的濃度為1～1.5m、三羥甲基氨基甲烷的濃度為10mm。兩個溶液腔室中電解液里的1-丁基-3-甲基咪唑氯化物濃度不同。
18、所述電解液的ph值為7.4。
19、進一步優選的，所述丁肝病毒大、小抗原質粒轉染細胞裂解液的具體構建如下：將修飾熒光標簽的丁型肝炎病毒大抗原過表達質粒或丁型肝炎病毒小抗原過表達質粒轉染至人肝癌細胞(huh7)細胞中，培養，收集細胞，-80℃保存。然后向轉染完畢的細胞中加入pbs+1×蛋白酶抑制劑+1×磷酸酶抑制劑，放于-80℃中冷凍，反復凍融震蕩，完全裂解細胞后，離心取上清，-80℃保存。
20、進一步優選的，所述丁肝病毒感染細胞裂解液的具體構建如下：用hdv感染穩定表達ntcp的huh7細胞，在hdv感染后第2天，收集細胞。然后向感染后的細胞中加入pbs+1×蛋白酶抑制劑+1×磷酸酶抑制劑，放于-80℃中冷凍，反復凍融震蕩，完全裂解細胞后，離心取上清，-80℃保存。
21、本專利技術的有益效果在于：
22、本專利技術公開了一種納米孔傳感體系在單分子和細胞層面檢測丁型肝炎病毒抗原的方法，通過在電化學檢測裝置中設置納米孔，采集丁肝病毒抗原蛋白、丁肝病毒抗原質粒轉染細胞裂解液或丁肝病毒感染細胞裂解液與納米孔相互作用的信號，對電信號的電流幅值、電信號阻滯時間、信號發生數量等特征進行分析，從而檢測丁型肝炎病毒大、小抗原含量、帶電性質等信息。本專利技術方法能夠對兩種丁型肝炎病毒抗原(l-hdag、s-hdag)純品進行檢測，并根據電化學檢測裝置中產生的電信號對兩種蛋白進行區分。本專利技術方法還能夠對丁肝病毒抗原過表達質粒轉染細胞及丁肝病毒感染細胞的裂解液進行檢測，對正常細胞和病毒細胞進行區分，實現納米孔與生物醫療學的交叉應用。本專利技術方法充分發揮納米孔檢測體系的無標記、快速、低成本、檢測方便的優點，精準記錄不同蛋白所引起的微小電流變化，可靠性高，靈敏度高、重復性好。
23、本專利技術是一種單分子水平上的檢測，不需要化學標記和免疫反應的直接檢測方法，更方便，且選擇性和靈敏性更高。是將納米孔單分子檢測技術在丁型肝炎病毒感染細胞上的首次應用。
24、本專利技術的其他優點、目標和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進行闡本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種納米孔檢測丁肝病毒抗原的方法，其特征在于，所述方法如下：
2.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于，所述納米孔電化學檢測裝置構建如下：將嵌有納米孔的支撐薄膜放置在兩個含有電解質的溶液腔室之間，在兩個溶液腔室之間構建電流回路，即形成所述納米孔電化學檢測裝置。
3.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述納米孔為MspA生物納米孔。
4.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述構建電流回路具體為：將兩個電極分別置于兩個溶液腔室中，兩個電極之間依次連接包括電源、電流表在內的裝置，形成電流回路。
5.根據權利要求書4所述的方法，其特征在于，所述電極為表面涂覆有氯化銀的銀電極。
6.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述溶液腔室中的電解液為1-丁基-3-甲基咪唑氯化物和三羥甲基氨基甲烷溶于水形成的混合溶液；
7.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述腔室材料為樹脂。
8.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于，構建丁肝病毒抗原質粒轉染細胞裂解液具體如下：將丁型肝炎病毒大抗原過表
9.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于，構建丁肝病毒感染細胞裂解液具體如下：用HDV感染穩定表達NTCP的Huh7細胞，在HDV感染后第2天，收集細胞；然后向感染后的細胞中加入PBS、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，放于-80℃中冷凍，反復凍融震蕩，完全裂解細胞后，離心取上清。
...【技術特征摘要】
1.一種納米孔檢測丁肝病毒抗原的方法，其特征在于，所述方法如下：
2.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于，所述納米孔電化學檢測裝置構建如下：將嵌有納米孔的支撐薄膜放置在兩個含有電解質的溶液腔室之間，在兩個溶液腔室之間構建電流回路，即形成所述納米孔電化學檢測裝置。
3.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述納米孔為mspa生物納米孔。
4.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述構建電流回路具體為：將兩個電極分別置于兩個溶液腔室中，兩個電極之間依次連接包括電源、電流表在內的裝置，形成電流回路。
5.根據權利要求書4所述的方法，其特征在于，所述電極為表面涂覆有氯化銀的銀電極。
6.根據權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述溶液腔室中的電解液為1-丁基-3-甲基咪唑...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王亮，趙羚喻，林永，陳云昊，王赟姣，周碩，鄧瑩瑩，
申請(專利權)人：中國科學院重慶綠色智能技術研究院，
類型：發明
國別省市：
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