【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥領域，具體而言，涉及一種檢測傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌功能的方法。
技術介紹
1、傷寒是由一種腸道沙門氏菌傷寒桿菌(salmonella?typhi,s.typhi)感染引起的全身性發熱疾病，主要出現于欠發達國家或發展中國家的貧困地區人口中，當今仍是一個重要的公共衛生問題。傷寒沙門氏菌通過受污染的水或食物經糞-口途徑傳播，通常與不良的衛生條件和衛生習慣有關。
2、在全球范圍內，最新估計每年存在1100萬至1800萬的傷寒感染負擔，感染人群以學齡或學齡以下的兒童為主。傷寒是許多欠發達國家或發展中國家貧困地區中最常見的菌血癥病因之一，大多數病例起源于南亞次大陸，然而在這些國家內，疾病負擔的分布往往是不均勻的，衛生條件差的地區受影響最大。在大多數發達國家，改善衛生基礎設施可明顯減輕疾病負擔，但為改善水和衛生設施而發展適當的基礎設施需要大規模投資，對于欠發達國家或發展中國家貧困地區的人口來講，這是一個遙遠的目標，因此在欠發達國家或發展中國家貧困地區進行疫苗接種仍然是最經濟有效的解決方法。
3、非劣效原則以及免疫學方法的檢測指標替代疫苗臨床效力判定終點已經應用于新的疫苗審批中。因此建立標準化的、國際上認可的免疫學檢測方法對疫苗的研發具有重要意義。常用的免疫學方法分為兩種：血清抗體濃度檢測(酶聯免疫吸附測定)和血清抗體的體外殺菌功能檢測。
4、血清抗體的體外殺菌功能檢測通常包括血清殺菌試驗和調理吞噬殺菌試驗兩種方式，通常，血清殺菌試驗通常用于革蘭氏陰性菌，而調理吞噬殺菌試驗通常用于革
5、腸道沙門氏菌傷寒桿菌屬于革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌的結構中存在脂多糖(lps)，即通常所說的內毒素。脂多糖具有高抗原性，會引起強烈的免疫反應。當將調理吞噬殺菌試驗應用于革蘭氏陰性菌時，革蘭氏陰性菌會在試驗過程中被更快地吞噬和殺死，不易得到穩定的試驗方法，因此調理吞噬殺菌試驗更常用于革蘭氏陽性菌，以便更穩定地控制試驗的過程。
6、在該領域研究中，還尚未確定傷寒結合疫苗的保護相關因素或替代物，同時沒有檢測傷寒疫苗的血清抗體的體外殺菌功能的方法。而判斷傷寒疫苗誘導的殺菌指數有著重要的意義，至今還沒有殺菌指數的檢測方法應用于實際臨床檢測評價中。
技術實現思路
1、為解決上述現有技術中所存在的問題，本專利技術創造性地將調理吞噬殺菌試驗應用于革蘭氏陰性菌傷寒桿菌，并通過調整試驗條件，得到穩定的試驗方法，以便快速、準確地計算出傷寒疫苗誘導的調理殺菌指數，從而有效評估傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌水平。
2、本專利技術提供了一種檢測傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌功能的方法。具體而言，本專利技術提供了：
3、(1)一種檢測傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌功能的方法，包括采用調理吞噬殺菌試驗檢測所述傷寒疫苗免疫血清對傷寒桿菌的體外殺菌功能，其中在完成所述調理吞噬殺菌試驗的吞噬殺菌步驟后，在7.5至9.5的ph下培養經過所述吞噬殺菌步驟的傷寒桿菌。
4、(2)根據(1)所述的方法，其中所述方法包括以下步驟：
5、1)對所述傷寒疫苗免疫血清進行補體滅活和稀釋，得到稀釋的滅活血清；
6、2)將所述稀釋的滅活血清與傷寒桿菌混合孵育，得到經調理的混合菌液；
7、3)將吞噬細胞、補體與所述經調理的混合菌液混合孵育，得到經殺菌的混合菌液；
8、4)在培養基中，在35℃至37℃且7.5至9.5的ph下培養所述經殺菌的混合菌液12小時至18小時；以及
9、5)對菌落進行計數，根據經過上述步驟2)至4)的傷寒桿菌的生長情況確定所述傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌功能。
10、(3)根據(2)所述的方法，其中在步驟1)中，所述補體滅活的溫度為56℃，時間為30分鐘至60分鐘。
11、(4)根據(2)所述的方法，其中在步驟1)中，將所述血清稀釋2至150000倍。
12、(5)根據(2)所述的方法，其中在步驟2)中，進行所述混合孵育的傷寒桿菌的光密度od600為0.7至1.0，并且所述稀釋的滅活血清和所述傷寒桿菌的體積比的范圍為1.5:1至2.5:1。
13、(6)根據(2)所述的方法，其中在步驟2)中，所述混合孵育的時間為30分鐘至60分鐘，溫度為20℃至25℃。
14、(7)根據(2)所述的方法，其中在步驟3)中，所述吞噬細胞為經誘導分化后的hl60細胞。
15、(8)根據(2)所述的方法，其中在步驟3)中，所述吞噬細胞的濃度為1×107個細胞/ml，并且所述吞噬細胞、所述補體和所述經調理的混合菌液的體積比為(4.1-4.3):(0.9-1.1):(2.9-3.1)。
16、(9)根據(2)所述的方法，其中在步驟3)中，所述混合孵育在35℃至37℃下進行0.5小時至3小時，優選進行1.5小時至3小時。
17、(10)根據(2)所述的方法，其中在步驟2)和3)中，所述稀釋的滅活血清被傷寒桿菌、吞噬細胞、補體的溶液進一步稀釋，使得所述稀釋的滅活血清具有最終稀釋倍數，在步驟5)中，將獲得50％殺菌率時的血清的最高所述最終稀釋倍數作為所述傷寒疫苗免疫血清的調理殺菌指數。
18、本專利技術與現有技術相比具有以下優點和積極效果：
19、本專利技術的方法打破了傷寒疫苗血清學評價領域內對于革蘭氏陰性菌常規選擇血清殺菌試驗來評價其血清體外殺菌功能的慣性思維，首次創造性地將調理吞噬殺菌試驗應用于革蘭氏陰性菌傷寒桿菌，并有效且準確地評估了傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌水平，填補了全球領域內僅使用酶聯免疫吸附測定(elisa)評估傷寒疫苗效果的空缺，提供了傷寒疫苗血清學評價領域內的新的體外殺菌功能檢測方法。
20、此外，本專利技術巧妙地改進了調理吞噬殺菌試驗的條件，將經過吞噬殺菌步驟的傷寒桿菌的培養生長環境的ph調整為7.5至9.5，從而使得菌落形態更為清晰，能夠通過平板菌落計數法對菌落進行計數，該計數方式快速、簡便易行，并且能夠直觀且準確地體現菌落數目，從而提高了檢測方法的可靠性、準確性和檢測速度。
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1.一種檢測傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌功能的方法，包括采用調理吞噬殺菌試驗檢測所述傷寒疫苗免疫血清對傷寒桿菌的體外殺菌功能，其中在完成所述調理吞噬殺菌試驗的吞噬殺菌步驟后，在7.5至9.5的pH下培養經過所述吞噬殺菌步驟的傷寒桿菌。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟1)中，所述補體滅活的溫度為56℃，時間為30分鐘至60分鐘。
4.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟1)中，將所述血清稀釋2至150000倍。
5.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟2)中，進行所述混合孵育的傷寒桿菌的光密度OD600為0.7至1.0，并且所述稀釋的滅活血清和所述傷寒桿菌的體積比的范圍為1.5:1至2.5:1。
6.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟2)中，所述混合孵育的時間為30分鐘至60分鐘，溫度為20℃至25℃。
7.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟3)中，所述吞噬細胞為經誘導分化后的HL60細胞。
8.根據權利要求2所述的方法，其中在步
9.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟3)中，所述混合孵育在35℃至37℃下進行0.5小時至3小時，優選進行1.5小時至3小時。
10.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟2)和3)中，所述稀釋的滅活血清被傷寒桿菌、吞噬細胞、補體的溶液進一步稀釋，使得所述稀釋的滅活血清具有最終稀釋倍數，并且在步驟5)中，將獲得50％殺菌率時的血清的最高所述最終稀釋倍數作為所述傷寒疫苗免疫血清的調理殺菌指數。
...【技術特征摘要】
1.一種檢測傷寒疫苗免疫血清的體外殺菌功能的方法，包括采用調理吞噬殺菌試驗檢測所述傷寒疫苗免疫血清對傷寒桿菌的體外殺菌功能，其中在完成所述調理吞噬殺菌試驗的吞噬殺菌步驟后，在7.5至9.5的ph下培養經過所述吞噬殺菌步驟的傷寒桿菌。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟1)中，所述補體滅活的溫度為56℃，時間為30分鐘至60分鐘。
4.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟1)中，將所述血清稀釋2至150000倍。
5.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟2)中，進行所述混合孵育的傷寒桿菌的光密度od600為0.7至1.0，并且所述稀釋的滅活血清和所述傷寒桿菌的體積比的范圍為1.5:1至2.5:1。
6.根據權利要求2所述的方法，其中在步驟2)中，所述混合孵育的時間...
【專利技術屬性】
技術研發人員：任浩鋒，譚小梅，羅樹權，周海飛，喬瑞潔，
申請(專利權)人：蘭州生物制品研究所有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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