【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于核酸合成，具體涉及一種寡聚核苷酸引物的合成工藝。
技術介紹
1、目前，oligodna的合成一般都采用固相亞磷酰胺三酯法，亞磷酰胺三酯法是將dna固定在固相載體上，經過四步循環反應：脫保護、耦聯、加帽、氧化，逐一將一個一個核苷酸單體連接上去，最終完成dna鏈的合成。此法具有高效、快速偶聯、起始反應物比較穩定的優點。
2、該方法的特點：
3、·第一個核苷酸是3’固定在固相載體上；
4、·每一個核苷酸依次連接上去；
5、·dna合成的方向是3’→5’；
6、·合成是在疏水環境中進行。
7、在所有合成循環結束后，就得到一個目標dna片段粗品，首先需經過氨解步驟，然后再通過各種方式進行純化。其中氨解包括切割步驟：將合成好的寡聚核苷酸從固體載體(cpg)上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解cpg上連接化合物與初始核苷間的酯鍵。
8、氨解的問題主要包括反應時間長，55℃反應需要16h，65℃反應需要8h，生產效率低，在高溫高壓的反應條件下進行氨解反應。氣相氨解的優勢在于反應快速高效、操作簡單，但是存在對設備要求高、需要使用有毒氣體、存在安全隱患、污染環境、對引物的結構破壞性較大的缺點。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，以解決氨解反應速率慢的問題。
2、本專利技術的目的可以通過以下技術方案實現：
3、一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，包括
4、第一步、將干燥氯甲基化聚苯乙烯樹脂加入甲苯中，溶脹后，加入對二氨基偶氮苯，在70℃條件下攪拌反應，反應結束后，乙醇抽提、洗滌、干燥，得到微球；在微球表面負載保護基得到固相載體；
5、第二步、合成引物：在固相載體上完成引物的合成，得到引物粗產物；氨解反應：將含有引物粗產物的固相載體放入氨解液中，進行氨解；所述氨解在紫外光和可見光交替下進行；
6、第三步、純化引物。
7、進一步地，所述氨解液包括有機胺、醇和堿性水溶液；有機胺、醇和堿性水溶液的用量質量比為5：1：0.1；有機胺包括二亞乙基三胺和三(2-氨基乙基)胺；醇包括甲醇和乙醇；堿性水溶液為1mol/l的氫氧化鈉、1mol/l氫氧化鉀水溶液。氨解液中的有機胺更加溫和，并且氨解液中加入了適量的堿性水溶液，提供了充足的氫氧根離子，不僅可以提高反應速率，而且可以避免常規氨水作為氨解液時存在殘留的情況。
8、進一步地，紫外光和可見光交替下進行：紫外光(uv＜366nm)照射10min；可見光(可見光＞400nm)照射10min。
9、進一步地，所述含有核酸的固相載體的制備方法為固相亞磷酰胺法，具體步驟如下：
10、采用脫保護劑對固相載體表面的保護基進行脫保護反應；將帶有保護基的核酸片段與羥基進行偶聯反應，得到偶聯物；對偶聯物進行氧化反應，得到氧化產物；對氧化產物進行蓋帽反應，得到含有引物粗產物的固相載體。
11、進一步地，所述純化包括hplc純化、opc純化、脫鹽純化。
12、進一步地，所述保護基為4,4′-二甲氧三苯甲基。(在微球表面負載保護基得到固相載體的步驟參照梁洪；李鵬；張競；蘇志國.聚苯乙烯基質rna固相有機合成載體的制備與性能表征[j].過程工程學報,2009,9(04):770-775.中的氨甲基聚苯乙烯載體與間臂的偶聯)。
13、進一步地，所述氯甲基化聚苯乙烯樹脂的氯含量為4meq/gm；所述氯甲基化聚苯乙烯樹脂的粒度為50-60μm。
14、進一步地，所述氯甲基化聚苯乙烯樹脂和對二氨基偶氮苯的用量質量比為12：0.8-1。
15、進一步地，所述氨解溫度為50-65℃。
16、本專利技術的有益效果：
17、本專利技術提供了一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其中涉及的氨基過程效率更高，氨解條件更加溫和，引物合成過程中不易產生錯誤序列，且產物純度比較高。
18、本專利技術中的寡聚核苷酸引物的合成工藝采用固相合成，其中固相載體中引入了偶氮結構，利用自制的固相載體，結合紫外光照提高氨解過程中的效率。在光照條件下，使固相載體中偶氮苯中共價鍵的結構從反式變成順式，這種異構化作用所產生的扭轉力，可以提高引物脫離固相載體的效率，進而縮短。氨解過程時間，提高氨解效率。
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1.一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述氨解液包括有機胺、醇和堿性水溶液；有機胺、醇和堿性水溶液的用量質量比為5：1：0.1；有機胺包括二亞乙基三胺和三(2-氨基乙基)胺；醇包括甲醇和乙醇；堿性水溶液為1mol/L的氫氧化鈉、1mol/L氫氧化鉀水溶液。
3.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，紫外光和可見光交替下進行：紫外光照射10min；可見光照射10min。
4.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述含有核酸的固相載體的制備方法為固相亞磷酰胺法，具體步驟如下：
5.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述純化包括HPLC純化、OPC純化、脫鹽純化。
6.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述保護基為4,4′-二甲氧三苯甲基。
7.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述氯甲基化聚苯
8.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述氯甲基化聚苯乙烯樹脂和對二氨基偶氮苯的用量質量比為12：0.8-1。
9.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述氨解溫度為50-65℃。
...【技術特征摘要】
1.一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述氨解液包括有機胺、醇和堿性水溶液；有機胺、醇和堿性水溶液的用量質量比為5：1：0.1；有機胺包括二亞乙基三胺和三(2-氨基乙基)胺；醇包括甲醇和乙醇；堿性水溶液為1mol/l的氫氧化鈉、1mol/l氫氧化鉀水溶液。
3.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，紫外光和可見光交替下進行：紫外光照射10min；可見光照射10min。
4.根據權利要求1所述的一種寡聚核苷酸引物的合成工藝，其特征在于，所述含有核酸的固相載體的制備方法為固相亞磷酰胺法，具體步驟如下：
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【專利技術屬性】
技術研發人員：劉宗文，雍金貴，劉奇，高恩，潘紅，
申請(專利權)人：通用生物安徽股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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