【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術提供了一種高純度、大規模純化細菌細胞外囊泡的有效方法。具體來說，本專利技術涉及一種使用鈣陽離子或者鈷陽離子從大量細菌細胞培養物中快速并方便地分離和純化高純度細菌細胞外囊泡的方法。
技術介紹
1、已知包括細菌的所有細胞都會天然分泌細胞外囊泡。細菌細胞外囊泡是尺寸為約10nm-1000nm的囊泡，并且由細菌的多種生物活性物質組成，如蛋白質、脂質、遺傳物質(例如dna和rna)以及毒力因子。細菌細胞外囊泡可分為來自革蘭氏陰性細菌的細胞外囊泡和來自革蘭氏陽性細菌的細胞外囊泡，且其中革蘭氏陰性細菌的細胞外囊泡又稱為外膜囊泡(omv)。已知細菌細胞外囊泡具有信息載體的功能，例如在相同物種之間遞送蛋白質或遺傳物質，幫助殺死競爭細菌，提高細菌的存活率，以及通過向宿主遞送毒素來調節由細菌引起的傳染病的發病機制。
2、最近，據報道，各種細菌細胞外囊泡對包括癌癥在內的各種疾病具有直接療效，并且還能有效地作為藥物載體以治療這些疾病(韓國專利注冊號：no.10-1752506)。此外，細菌細胞外囊泡還被研究用作疫苗，以預防或治療由致病細菌引起的傳染病，如腦膜炎。由于這些細菌細胞外囊泡不是活細胞，因此可以長期儲存和運輸，而且感染風險低。
3、隨著將細菌細胞外囊泡用于包括治療疾病在內的各種目的的可能性越來越大，有必要開發一種從細菌細胞培養物種獲取大量細菌細胞外囊泡的方法。然而，細菌細胞外囊泡小至納米級別，而且細菌細胞培養物中不僅含有細胞外囊泡，還含有許多微觀物質，包括其他蛋白質顆粒(例如鞭毛蛋白顆粒)或者核酸顆粒，其與細胞外
4、目前分離細菌細胞外囊泡的技術利用了密度、粒度和免疫親和性的差異。例如使用超速離心法(ultracentrifugation)(momen-heravi?et?al.,methods?mol.biol.,1660:25-32,2017)、尺寸排阻法(gamez-valero?et?al.,sci.rep.6:33641,2016)、免疫親和分離法、微流體芯片技術和聚合物沉淀法(niu?et?al.,plos?one,0186534,2017)。
5、密度梯度分離法是一種利用液體密度為約1.0，而細胞外囊泡密度為約1.13至1.19進行分離的方法。通常情況下，超速離心法因其原理簡單而應用最廣泛且最可靠。但是，由于復雜的分離步驟，需要大量的人力和時間，需要昂貴的設備，一次最多只能處理0.6l的液體，而且產量和純度顯著偏低，因此不適合獲得大量的細菌細胞外囊泡。
6、尺寸排阻法是一種利用孔徑小于或者類似于細菌細胞外囊泡的過濾器過濾細胞外囊泡的方法。由于這種方法不需要反應時間，因此高純度細胞外囊泡可以被快速分離。不過，分離后的產量較低，因為相當一部分細胞外囊泡會黏附在過濾器上或被過濾出。
7、免疫親和分離法是一種通過將抗體附著在細菌細胞外囊泡上來分離細胞外囊泡的方法，且具有很高的特異性。然而，抗體制作需要很長時間，而且價格昂貴，因此不太實用。
8、聚合物沉淀法是一種洗脫和沉淀細菌細胞外囊泡的方法，通過添加親水性聚合物(如聚乙二醇(peg))以降低細菌細胞外囊泡的溶解度。使用這種方法，可以用較低的離心力分離細菌細胞外囊泡。然而，由于樣品溶液中存在的蛋白質的共沉淀，添加的聚合物可能會造成蛋白質污染。
9、目前，一種革蘭氏陰性細菌omv分離試劑盒是商業上可獲得的(exobacteriatm?omv試劑盒；sbi)。該試劑盒利用omv親和樹脂柱。然而，這種試劑盒不適合大規模生產，因為它一次只能處理30ml。
10、因此，有必要開發一種大規模分離細菌細胞外囊泡的簡單方法。當務之急是開發一種方法，所述方法用于有效地從其他細菌蛋白質顆粒(例如鞭毛蛋白顆粒)或者核酸顆粒中分離和純化出高純度的細菌細胞外囊泡，同時保留囊泡的結構和功能。
11、現有技術文件
12、專利文件
13、(非專利文件0001)momen-heravi?et?al.,methods?mol.biol.,1660:25-32,2017
14、(非專利文件0002)gamez-valero?et?al.,sci.rep.6:33641,2016
15、(非專利文件0003)niu?et?al.,plos?one,0186534,2017
技術實現思路
0、專利技術概述
1、技術問題
2、本專利技術的目的是提供一種通過處理大量細菌培養物來簡單快速地分離和純化高濃度細菌細胞外囊泡的方法。
3、本專利技術的另一個目的是提供一種高效地分離高濃度細菌細胞外囊泡的方法，解決了使用現有分離技術時，蛋白質顆粒或核酸顆粒與細菌細胞外囊泡共同分離的問題。
4、技術解決方案
5、本專利技術的完成基于意想不到的研究結果，這些結果表明，鈣陽離子或鈷陽離子能夠純化高濃度的細菌細胞外囊泡，并可以用于大規模處理。
6、在本專利技術中，用鈣陽離子或鈷陽離子處理細菌細胞培養物時，細菌細胞外囊泡與鈣陽離子或鈷陽離子形成不溶性復合物。鈣陽離子或鈷陽離子能夠有效抑制細菌細胞外囊泡以外的細菌的蛋白質或核酸的共沉淀，從而能從細菌細胞培養物中分離純化出高濃度細菌細胞外囊泡。所得到的細菌細胞外囊泡-鈣陽離子或鈷陽離子復合物可以通過離心或者重力沉淀等各種方法分離出來。然后，通過將鈣陽離子或鈷陽離子從復合物中分離出來，可以高效、簡單地純化細菌細胞外囊泡。
7、本專利技術提供了一種大規模純化細菌細胞外囊泡的方法，包括以下步驟：(a)向細菌細胞培養物中添加鈣陽離子或鈷陽離子；(b)使細菌細胞培養物中的細菌細胞外囊泡與鈣陽離子或鈷陽離子反應形成不溶性復合物；(c)從細菌細胞培養物中分離出細菌細胞外囊泡與鈣陽離子或鈷陽離子的復合物；(d)從復合物中分離出鈣陽離子或鈷陽離子，以純化細菌細胞外囊泡。
8、本專利技術的方法對處理能力沒有限制，可以進行大規模處理。因此，本專利技術的方法可以簡單、快速地純化出大量高濃度細菌細胞外囊泡，并可以商業化實施。
9、本專利技術中的術語“細菌細胞外囊泡”可以指源自細菌的外膜囊泡、脫落囊泡、外泌體(exosomes)、核外顆粒(ectosomes)、微囊泡、微粒子和納米囊泡，所有這些均可理解為包括在本專利技術的細菌細胞外囊泡的范圍內。西外，革蘭氏陰性細菌細胞外囊泡包括源于外膜的細胞外囊泡、源于內膜的細胞外囊泡和源于內/外膜的細胞外囊泡(以外膜和內膜的成分同時存在，或內膜在外膜內，或相反地，外膜在內膜內的形式存在)，其也被理解為包括在本專利技術的細菌細胞外囊泡中。
10、本專利技術的術語“細菌細胞培養物”是指培養細菌細胞(包括經遺傳修飾的細菌)的培養基。培養基并沒有特別的限制，只要是用于培養細菌細胞就可以，包括使用不明確成分的天然材料(如血清和組織提取本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種大規模純化細菌細胞外囊泡的方法，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述鈣陽離子或鈷陽離子的濃度為1-1000mM、1-500mM、1-100mM、5-100mM、5-50mM、5-20mM、5-15mM、或5-10mM。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述鈣陽離子或鈷陽離子的濃度為5-20mM。
4.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(c)是通過選自由以下組成的組的一種或多種方法進行的：離心、超速離心、過濾、超濾、重力、透析、超聲、密度梯度和尺寸排阻。
5.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(d)是通過選自由以下組成的組的一種或多種方法進行的：添加螯合劑，改變pH值，或者改變咪唑、組氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)或鹽的濃度。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述螯合劑是選自由以下組成的組的一種或多種：亞氨基二乙酸(IDA)、氨三乙酸(NTA)、三-(羧甲基)乙二胺(TED)、乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、烷基二胺三乙酸、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二醇雙(β-氨基乙基醚)-N,N,N
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述方法還包括在步驟(a)之前對細菌細胞培養物進行的預處理步驟，還包括在步驟(d)之后對純化的細菌細胞培養物進行的后處理步驟，或者包括所述預處理和所述后處理兩個步驟。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述預處理步驟通過選自由以下組成的組的一種或者多種方法進行：離心、過濾、超濾、尺寸排阻、脫鹽柱色譜法、尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、聚合物沉淀、鹽沉淀、有機溶劑沉淀、雙水相系統和酶處理。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述預處理步驟通過離心、過濾、聚合物沉淀或鹽沉淀進行。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述預處理步驟通過切向流過濾(TFF)進行。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述預處理步驟在切向流過濾(TFF)后通過聚合物沉淀或鹽沉淀進一步進行。
12.根據權利要求7所述的方法，其中所述后處理步驟通過選自由以下組成的組的一種或者多種方法進行：離心、過濾、超濾、透析、超聲、密度梯度、尺寸排阻、脫鹽柱色譜法、尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、聚合物沉淀、鹽沉淀、有機溶劑沉淀、雙水相系統和酶處理。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述后處理步驟通過超濾、透析、尺寸排阻、尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法、聚合物沉淀或鹽沉淀進行。
14.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述方法還包括一個酶處理步驟，用于在步驟(a)之前、步驟(b)之后、步驟(c)之后或者步驟(d)之后去除來自細菌的核酸顆粒。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述酶處理步驟通過使用全能核酸酶進行。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述方法包括與全能核酸酶處理組合進行離子交換色譜法或在全能核酸酶處理后進行離子交換色譜法的步驟。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種大規模純化細菌細胞外囊泡的方法，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述鈣陽離子或鈷陽離子的濃度為1-1000mm、1-500mm、1-100mm、5-100mm、5-50mm、5-20mm、5-15mm、或5-10mm。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述鈣陽離子或鈷陽離子的濃度為5-20mm。
4.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(c)是通過選自由以下組成的組的一種或多種方法進行的：離心、超速離心、過濾、超濾、重力、透析、超聲、密度梯度和尺寸排阻。
5.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(d)是通過選自由以下組成的組的一種或多種方法進行的：添加螯合劑，改變ph值，或者改變咪唑、組氨酸、乙二胺四乙酸(edta)或鹽的濃度。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述螯合劑是選自由以下組成的組的一種或多種：亞氨基二乙酸(ida)、氨三乙酸(nta)、三-(羧甲基)乙二胺(ted)、乙二胺、乙二胺四乙酸(edta)、烷基二胺三乙酸、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、乙二醇雙(β-氨基乙基醚)-n,n,n’,n’-四乙酸(egta)、磷酸絲氨酸和1,4,7-三氮雜環壬烷(tacn)。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述方法還包括在步驟(a)之前對細菌細胞培養物進行的預處理步驟，還包括在步驟(d)之后對純化的細菌細胞培養物進行的后處理步驟，或者包括所述預處理和所述后處理兩個步驟。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述預處...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李昌津，宋成炫，金始源，李泰龍，
申請(專利權)人：羅塞塔外排體株式會社，
類型：發明
國別省市：
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