本發明專利技術提供了一種有效治療卵巢功能減退的羊膜間充質干細胞的篩選方法，屬于細胞治療技術領域。本發明專利技術對不同來源或批次的羊膜間充質干細胞或其外泌體的miRNA320a進行RT?qPCR檢測，根據不同的羊膜間充質干細胞或其外泌體miRNA320a的表達量存在一定的差異，表明miRNA320a的表達量使羊膜間充質干細胞對卵巢功能減退的治療起關鍵調節作用，且通過羊膜間充質干細胞培養上清與過氧化氫處理后的卵巢顆粒細胞共培養后卵巢顆粒細胞中miRNA320a的表達補充驗證進一步確定本發明專利技術篩選方法的合理性。因此，采用本發明專利技術提供的篩選方法能夠得到符合有效治療卵巢功能減退標準的人羊膜間充質干細胞，具有重要的醫學價值和經濟價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞治療，具體涉及一種有效治療卵巢功能減退的羊膜間充質干細胞的篩選方法。
技術介紹
1、卵巢功能減退是一種常見的婦科內分泌疾病，嚴重影響患者的生理、生育、心理健康，但目前針對卵巢功能減退的治療方法不能從根本上恢復患者的卵巢功能。間充質干細胞在各類疾病包括卵巢功能減退的研究中展現出良好的治療效果，已成為該領域的熱點研究方向，且各項研究已經深入到探究其內在治療機制。
2、外泌體是間充質干細胞釋放的30～150nm大小的小囊泡，可通過攜帶各種生物大分子(包括mrna、mirna、lncrna和蛋白質)介導細胞間通信。越來越多的證據表明，從羊膜間充質干細胞中提取的外泌體可抑制小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡。然而，不同來源和不同生產批次的羊膜間充質干細胞的特性不同。目前針對羊膜間充質干細胞的檢測僅包括常規質量檢測和有效性常規檢測，不能篩選得到符合治療卵巢功能減退指標的羊膜間充質干細胞。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種治療卵巢功能減退的羊膜間充質干細胞的篩選方法，通過檢測mirna320a的表達量，篩選出符合標準的羊膜間充質干細胞，從而建立一種人羊膜來源間充質干細胞治療卵巢功能減退的有效性指標。
2、本專利技術提供了一種有效治療卵巢功能減退的羊膜間充質干細胞的篩選方法，包括以下步驟：
3、分別提取待檢測的羊膜間充質干細胞或其外泌體和卵巢顆粒細胞的rna；
4、分別以提取的rna為模板，合成第一鏈cdna；
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p>5、以合成的第一鏈cdna為模板，利用qpcr技術檢測細胞中mirna320a的表達水平，根據mirna320a的表達水平，判斷羊膜間充質干細胞或其外泌體在治療卵巢功能減退方面的有效性：6、當羊膜間充質干細胞或其外泌體中mirna320a的表達量為卵巢顆粒細胞表達量2倍以上，則間充質干細胞或其外泌體具有有效治療卵巢功能減退的作用；
7、反之，則認為不具有治療卵巢功能減退的作用。
8、優選的，合成第一鏈cdna用莖環引物的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。
9、優選的，mirna320a的qpcr擴增用引物包括核苷酸序列如seq?id?no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no:3所示的反向引物。
10、優選的，qpcr檢測時，反應體系為10μl，包括以下組分：5μl?2×master?qpcr?mix、0.4μl正向引物、0.4μl反向引物、1μl第一鏈cdna和3.2μl?ddh2o。
11、優選的，qpcr檢測時，反應程序為50℃2min，1個循環；95℃2min，1個循環；95℃15s，60℃30s，40個循環。
12、優選的，將篩選的具有治療卵巢功能減退作用的間充質干細胞進行驗證；
13、所述驗證的方法包括以下步驟：
14、將卵巢顆粒細胞置于含羊膜間充質干細胞培養上清和過氧化氫的培養基中培養，記為羊膜間充質干細胞處理組；
15、將卵巢顆粒細胞置于僅含過氧化氫的培養基中培養，記為模型組；
16、根據培養后的卵巢顆粒細胞的存活率進行判斷：
17、當羊膜間充質干細胞處理組卵巢顆粒細胞的存活率與模型組相比有顯著升高，說明羊膜間充質干細胞具有卵巢功能減退的治療有效性；反之，則認為無效。
18、優選的，所述分泌因子包括tnf-α和/或tnf-r1；
19、所述過氧化氫的處理濃度為1.6～2.4mm；
20、所述培養的時間為1～4h；
21、羊膜間充質干細胞處理組卵巢顆粒細胞的存活率的檢測時間點包括培養1h、2h、3h或4h。
22、優選的，所述羊膜間充質干細胞培養上清的制備方法，將復蘇后的羊膜間充質干細胞接種至msc-q完全培養基中培養，分離上清；
23、所述培養的時間為3～4d；
24、所述羊膜間充質干細胞的接種密度為(0.7～0.95)×104/cm2。
25、優選的，還包括羊膜間充質干細胞的質量控制常規檢測和有效性常規檢測；
26、所述羊膜間充質干細胞的質量控制常規檢測包括細胞形態、活率檢測、細胞表面標志物檢測、間充質干細胞的成脂分化、成骨分化和成軟骨分化檢測；
27、羊膜間充質干細胞的有效性常規檢測包括淋巴細胞增殖抑制試驗、特定淋巴細胞亞群檢測和淋巴細胞分泌tnf-α抑制試驗。
28、本專利技術提供了羊膜間充質干細胞在制備治療卵巢功能減退的藥物中的應用，所述羊膜間充質干細胞為所述方法篩選的有效治療的羊膜間充質干細胞。
29、本專利技術提供了一種有效治療卵巢功能減退的羊膜間充質干細胞的篩選方法，包括以下步驟：分別提取待檢測的羊膜間充質干細胞或其外泌體和卵巢顆粒細胞的rna；分別以提取的rna為模板，合成第一鏈cdna；以合成的第一鏈cdna為模板，利用qpcr技術檢測細胞中mirna320a的表達水平，根據mirna320a的表達水平，判斷羊膜間充質干細胞或其外泌體在治療卵巢功能減退方面的有效性：當羊膜間充質干細胞中mirna320a的表達量為卵巢顆粒細胞表達量2倍以上，則間充質干細胞或其外泌體具有治療卵巢功能減退的作用；反之，則認為不具有治療卵巢功能減退的作用。本專利技術對不同來源或批次的羊膜間充質干細胞或其外泌體的mirna320a進行rt-qpcr檢測，根據不同的羊膜間充質干細胞或其外泌體mirna320a的表達量存在一定的差異，表明mirna320a的表達量使羊膜間充質干細胞對卵巢功能減退的治療起關鍵調節作用，并且基于羊膜間充質干細胞與卵巢顆粒細胞中mirna320a的表達量的差異從而作為判斷是否有效性的標準。由此提出，篩選出符合有效治療卵巢功能減退標準的人羊膜間充質干細胞具有重要的醫學價值和經濟價值。
30、進一步的，本專利技術還提供了驗證方法。通過人羊膜間充質干細胞培養上清與過氧化氫(hydrogenperoxide，h2o2)處理后的卵巢顆粒細胞共培養后卵巢顆粒細胞的活率進行檢測，發現細胞活率和mirna320a的表達水平呈現正相關，當羊膜間充質干細胞處理組卵巢顆粒細胞的存活率與模型組相比有顯著升高，說明羊膜間充質干細胞具有卵巢功能減退的治療有效性；反之，則認為無效。該方法從動物水平上驗證，從卵巢功能減退組織病理學檢查和相關分泌因子檢測結果兩個角度表明，篩選得到的間充質干細胞能有效治療對卵巢功能減退，使卵巢病變有減輕趨勢。
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【技術保護點】
1.一種有效治療卵巢功能減退的羊膜間充質干細胞的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，合成第一鏈cDNA用莖環引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
3.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，miRNA320a的qPCR擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示的反向引物。
4.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，qPCR檢測時，反應體系為10μl，包括以下組分：Master?qPCRMix、0.4μl正向引物、0.4μl反向引物、1μl第一鏈cDNA和3.2μl?ddH2O。
5.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，qPCR檢測時，反應程序為50℃2min，1個循環；95℃2min，1個循環；95℃15s，60℃30s，40個循環。
6.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，將篩選的具有治療卵巢功能減退作用的間充質干細胞進行驗證；
7.根據權利要求6所述篩選方法，其特征在于，所述分泌因子包括TNF-α和/或TNF-R1；
8.根據權利要求6所述篩選方法，其特征在于，所述羊膜間充質干細胞培養上清的制備方法，將復蘇后的羊膜間充質干細胞接種至MSC-Q完全培養基中培養，分離上清；
9.根據權利要求1～8中任意一項所述篩選方法，其特征在于，還包括羊膜間充質干細胞的質量控制常規檢測和有效性常規檢測；
10.羊膜間充質干細胞或其外泌體在制備治療卵巢功能減退的藥物中的應用，所述羊膜間充質干細胞為權利要求1～9中任意一項所述方法篩選的有效治療的羊膜間充質干細胞或其外泌體。
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【技術特征摘要】
1.一種有效治療卵巢功能減退的羊膜間充質干細胞的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，合成第一鏈cdna用莖環引物的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。
3.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，mirna320a的qpcr擴增用引物包括核苷酸序列如seq?id?no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no:3所示的反向引物。
4.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，qpcr檢測時，反應體系為10μl，包括以下組分：master?qpcrmix、0.4μl正向引物、0.4μl反向引物、1μl第一鏈cdna和3.2μl?ddh2o。
5.根據權利要求1所述篩選方法，其特征在于，qpcr檢測時，反應程序為50℃2min，1個循環；95℃2m...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊袁，劉云，鄭春兵，郭海春，余思捷，顏騰龍，華江舟，
申請(專利權)人：長沙干細胞與再生醫學工業技術研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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