【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)中的基因工程，具體為一種nrf2基因干擾hepg2細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它與抗氧化應(yīng)激和細胞甚至整個生物體對環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)，其在生命體的許多領(lǐng)域中都具有重要作用，如癌癥，心血管疾病，神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病等。nrf2是一個很重要的參與調(diào)節(jié)的基因，作為被廣泛研究的抗氧化基因之一，其功能與機體對于氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞防御緊密相關(guān)，可以調(diào)節(jié)活性氧清除劑和抗炎分子的合成及其轉(zhuǎn)錄和翻譯后的表達。
2、目前許多研究已經(jīng)表明，nrf2在預(yù)防和治療心血管疾病、中風(fēng)和癌癥等方面具有積極的作用，其除了在除氧化應(yīng)激和毒性的物質(zhì)，同時在癌細胞生長和分裂方面也發(fā)揮了重要作用。nrf2的活化可以誘導(dǎo)一系列抗癌基因的表達，如細胞周期調(diào)節(jié)基因、dna修復(fù)基因以及凋亡相關(guān)的基因等，降低腫瘤細胞增殖速度和遷移能力，并抵御肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥。反之，nrf2基因的抑制則可能導(dǎo)致一部分原癌基因的表達，從而引起癌癥細胞的快速增殖和腫瘤惡化。
3、綜上，為了研究nrf2基因在癌癥細胞中的具體作用以及機制，可以對宿主細胞進行nrf2基因表達量的調(diào)整，從而研究這些調(diào)整對于腫瘤細胞的的增殖速度和遷移能力的影響,hepg2細胞屬于肝癌細胞，目前關(guān)于nrf2基因?qū)epg2細胞株影響的報道鮮有。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種nrf2基因干擾hepg2細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，以彌補現(xiàn)有nrf2基因?qū)?span style='display:none'>hepg2細胞株的影響研究的空缺。
2、本專利技術(shù)的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
3、一種nrf2基因干擾hepg2細胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
4、步驟s1：nrf2基因的cds序列查找及三靶點設(shè)計，具體步驟如下：
5、在ncbi上查到nrf2基因的cds區(qū)域的序列，如seq?id?no.1所示，在所述nrf2基因的cds區(qū)域上設(shè)計三個感染靶點，如下所示：
6、nrf2-target1：agtttgggaggagctattatc
7、nrf2-target2：ccggcatttcactaaacacaa
8、nrf2-target3：gcaccttatatctcgaagttt；
9、步驟s2：三條shrna分別合成及慢病毒載體構(gòu)建，具體步驟如下：
10、將s1設(shè)計的三靶點，分別添加上載體上的酶切位點和loop環(huán)結(jié)構(gòu)，分別合成六個引物：
11、nrf2-shrna1-fp:gatccagtttgggaggagctattatcctcgaggataatagctcctcccaaactttttg；
12、nrf2-shrna1-rp:aattccaaaaagtttgggaggagctattatcctcgaggataatagctcctcccaaact
13、nrf2-shrna2-fp:gatccccggcatttcactaaacacaactcgagttgtgtttagtgaaatgccgtttttg
14、nrf2-shrna2-rp:aattccaaaaacggcatttcactaaacacaactcgagttgtgtttagtgaaatgccgg
15、nrf2-shrna3-fp:gatccgcaccttatatctcgaagtttctcgagaaacttcgagatataaggtgctttttg
16、nrf2-shrna3-rp:aattccaaaaagcaccttatatctcgaagtttctcgagaaacttcgagatataaggtgc；
17、將上述六個合成引物分別兩兩配對進行退火反應(yīng)，之后4℃儲存?zhèn)溆茫粚⒊樘岷玫母腥韭《究蛰d使用bamhi和ecori線性化之后膠回收用于后續(xù)的連接反應(yīng)，配制好連接反應(yīng)體系后，室溫離心，于pcr儀上25℃恒溫連接15分鐘，連接完成之后，進行感受態(tài)轉(zhuǎn)化，最終挑取單克隆進行擴增，然后進行質(zhì)粒抽提之后測序，得到測序驗證正確的克隆擴大進行質(zhì)粒大抽，最終得到測序驗證正確的大抽慢病毒質(zhì)粒：
18、步驟s3：shrna慢病毒包裝及感染hepg2細胞，具體步驟如下：
19、將上述測序驗證正確的大抽慢病毒質(zhì)粒分別進行慢病毒包裝，之后進行滴度測定，最終得到慢病毒，將得到的慢病毒分別以moi為20感染hepg2細胞株；
20、步驟s4：藥物篩選及干擾穩(wěn)定細胞株的的構(gòu)建，具體步驟如下：
21、在上述慢病毒感染的hepg2細胞株在感染72h時，使用1ug/ml的嘌呤霉素進行藥物篩選，篩選72h后，對存活下來的細胞進行擴大培養(yǎng)，分別得到構(gòu)建好的hepg2干擾細胞株；
22、步驟s5：qpcr檢測nrf2基因的干擾效率，具體步驟如下：
23、上述構(gòu)建好的hepg2干擾細胞株和野生型hepg2細胞株使用trizol方法進行rna提取之后，反轉(zhuǎn)錄成cdna之后進行qpcr檢測靶點的干擾效率即可。
24、進一步地，步驟s2中退火溫度為98℃，退火時間為10分鐘。
25、進一步地，本專利技術(shù)還提供了一種nrf2基因干擾hepg2細胞株，應(yīng)用于肝癌細胞的發(fā)病機制及治療方法的研究。
26、本專利技術(shù)的有益效果：
27、本專利技術(shù)提供了一種nrf2基因干擾hepg2細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，通過nrf2基因靶點干擾靶點設(shè)計，shrna序列合成，載體構(gòu)建及抽提，慢病毒包裝，慢病毒感染hepg2細胞株，藥物篩選穩(wěn)定細胞株構(gòu)建及檢測等步驟制得一種nrf2基因干擾hepg2細胞株，此構(gòu)建好的細胞株中,nrf2基因的表達量相對于未做任何處理的野生型hepg2細胞株表達量明顯下調(diào)，可以應(yīng)用于肝癌細胞的發(fā)病機制及治療方法的研究等領(lǐng)域。
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1.一種Nrf2基因干擾hepG2細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Nrf2基因干擾hepG2細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1中三個感染靶點，如下所示：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Nrf2基因干擾hepG2細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中六個引物，如下所示：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Nrf2基因干擾hepG2細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中退火溫度為98℃，退火時間為10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Nrf2基因干擾hepG2細胞株的應(yīng)用，其特征在于，所述Nrf2基因干擾hepG2細胞株應(yīng)用于肝癌細胞的發(fā)病機制及治療方法的研究。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種nrf2基因干擾hepg2細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種nrf2基因干擾hepg2細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中三個感染靶點，如下所示：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種nrf2基因干擾hepg2細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s2中六個引物，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉登輝，李雨晴，周金山，劉歡，
申請(專利權(quán))人：通用生物安徽股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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