一種從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶和ＳＯＤ粗酶的方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶和ＳＯＤ復合酶的方法。從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶的方法包括以下步驟：新鮮宣木瓜果實→清洗，去皮、去籽，研磨均勻→超聲提取→冷凍離心→上清液粗過濾→超濾→冷凍干燥→木瓜蛋白酶。從宣木瓜果實中提取ＳＯＤ酶的方法包括以下步驟：新鮮宣木瓜果實→清洗，去皮、去籽→加提取緩沖液，研磨均勻→冷凍離心→上清液→丙酮沉淀→超濾→冷凍干燥→ＳＯＤ復合酶。本方法提取木瓜蛋白酶和ＳＯＤ的過程中操作簡單，加工成本較低，所得酶的純度高，活力高。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶和SOD粗酶的方法一
技術介紹
本專利技術屬于生物工程領域，具體地說涉及一種木瓜蛋白酶和SOD酶的提取技術。
技術介紹
木瓜蛋白酶(Papain，E C 3. 4. 22. 2)又稱木瓜酶，是一類琉基蛋白酶。廣泛存在于番木瓜(Carica papaya)的果實、葉、莖和根內，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富[71]。 它具有熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全、酶活高等特點，因此在食品、日化、飼料、醫(yī)藥、紡織及皮 革等行業(yè)有廣泛應用。又因其穩(wěn)定性好，對多種蛋白質均具有較好的降解作用，并且蛋白水 解能力強，目前已被廣泛地應用于諸多行業(yè)。在食品行業(yè)中用于啤酒澄清、肉類嫩化、魚類 加工和飼料添加劑；在工業(yè)行業(yè)中用于蠶繭脫膠、明膠制造、皮革脫毛等；在醫(yī)療衛(wèi)生行 業(yè)中用于治療消化不良、驅腸蟲劑、水腫以及各種炎癥等疾病。現(xiàn)有文獻表明提取和利用木瓜蛋白酶已成為當今科技研究的熱點之一。以番木瓜 未成熟果實的新鮮乳汁為原科生產木瓜蛋白酶，由于番木瓜種植區(qū)主要分布于經濟不發(fā)達 地區(qū)，因此蛋白酶生產工藝相對落后。乙引等，就木瓜蛋白酶生產工藝中的幾個重要環(huán)節(jié)進 行了研究，采用單寧沉降法、烘干法等制備木瓜蛋白酶。試驗結果表明在木瓜蛋白酶的制 備過程中，要提高木瓜蛋白酶的質和量，必須要加入酶活性保護劑，減少酶失活，干燥過程 中溫度不宜過高，同時去除雜質。常用的酶保護劑有亞硫酸氫鈉、EDTA、焦亞硫酸鈉等。目 前，木瓜蛋白酶的提取主要采用化學方法，化學方法一方面工藝條件要求很多，操作過程比 較繁瑣，耗時耗能均較多；另一方面，需要使用大量的化學試劑，成本很高。木瓜蛋白酶傳統(tǒng) 提取方法存在嚴重缺陷木瓜青果乳汁割收方法落后，衛(wèi)生條件差，乳汁損失大，褐變嚴重， 酶活性低。目前，市場對木瓜蛋白酶需求量增長迅速，而目前的生產方式又不能滿足市場的 需求。超氧化物歧化酶(SOD)是一種具有特定生物催化功能的蛋白質，由金屬離子和蛋 白質組成，自然界的植物、動物以及一些微生物體內是SOD的主要存在載體。SOD不僅可以 作為蔬菜和水果的保鮮劑；還被作為抗氧化劑應用于果汁、罐頭食品、啤酒等食品中，防止 過氧化化物酶引起的食品腐敗和變質現(xiàn)象。在食品中加入SOD可以增強抗炎、抗疲勞、抗輻 射、抗衰老等保健作用。在應用領域的研究上，超氧化物歧化酶被用來當作選擇性殺傷癌細 胞的靶，通過破壞癌細胞超氧化物歧化酶活性，使癌細胞對毒性氧的防御能力喪失，最后使 癌細胞凋亡。超氧化物歧化酶對治療心肌梗塞、貝切特氏病等血管性心臟病、肺氣腫、新生 兒呼吸困難綜合癥、老年白內障、輻射病、膠原病、水腫以及等疾病也有療效。此外，對由于 化療引起的白血球減少和骨髓損傷的患者通過靜脈注射S0D，患者的恢復效果很好。超氧化 物歧化酶(SOD)除應用于肝、腎、心臟等器官的保存和移植外，也可應用于小腸和心臟動脈 缺血再灌注，及美容，整形、斷肢再植等手術過程。此外，重組SOD是通過基因工程技術制備 的，目前已廣泛應用于研究以及與應用直接相關的基礎理論研究。可見SOD在醫(yī)藥、食品及 化妝保健品領域，具有廣大市場前景。現(xiàn)有文獻表明在很多生物體中存在SOD酶，提取和利用SOD酶已成為當今科技研 究的熱點之一。專利申請?zhí)?6100551公開了一種超氧化物歧化酶的提純方法，它是將動物肝臟勻漿在二價銅鹽的的條件下分步加熱和透析沉淀除去雜質，提取SOD ；采用硫酸銨分 步鹽析，除去雜蛋白，收集含SOD的蛋白質，再經透析、濃縮、干燥，可獲得比活力為2789單 位/毫克的SOD。專利申請?zhí)枮?1101832公開了一種大豆超氧化物歧化酶生產方法，它是 以大豆(豆類)為原料生產大豆超氧化物歧化酶(大豆SOD)，其生產方法是將大豆依次經 過以下步驟制作膨脹大豆、制取豆?jié){、調值處理、離心處理的上清液、加熱過濾、超濾濃縮、 干燥等工序獲得SOD。但 上面專利申請均因技術措施或選取的原料不當而未實施。宣木瓜， 屬薔薇科木瓜屬、落葉闊葉灌木。宣木瓜的營養(yǎng)價值與彌猴桃相媲美，以“百益之果”著稱， 是衛(wèi)生部2003年公布30個藥食兼用食品之一。經過測定，宣木瓜果實中含有較高的SOD 活性，但至今沒有對其提取工藝進行深入的研究，經檢索，未發(fā)現(xiàn)有關從宣木瓜果實中提取 SOD酶的報道。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術提供一種從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶和SOD粗酶的方法。本專利技術的目的可以通過以下技術措施來實現(xiàn)一種從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將新鮮宣木瓜果實洗凈，去皮、去籽；(2)向步驟(1)處理過的果實里加蒸餾水進行研磨勻漿；(3)將步驟(2)的研磨勻漿采用超聲提取，通過冰浴的方法控制超聲溫度為 4-12°C ；(4)將經過超聲提取過的漿料用離心機冷凍離心分離，溫度為3_5°C，離心機的轉 速為 6000-10000r/min ；(5)將離心所得的上層清液采用200-600目的篩網(wǎng)及孔徑為5 μ m的袋式濾器進行 粗過濾，去除宣木瓜果漿中的雜質及不溶性成分，得到粗酶液；(6)將粗酶液采用截留分子量為9000-10000道爾頓的超濾膜超濾，分離小分子雜 質，得到超濾產物；(7)將超濾后的產物進行冷凍真空干燥，得木瓜蛋白酶。一種從宣木瓜果實中提取SOD復合酶的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將新鮮宣木瓜果實洗凈，去皮、去籽；(2)向步驟(1)處理過的果實里加入提取緩沖液進行研磨勻漿；(3)將步驟⑵的研磨勻漿采用離心機冷凍離心分離，得到的上層清液為粗酶液， 離心機的轉速為12000-20000r/min，溫度為4_12°C，分離時間為30_50min ；(4)將離心所得的粗酶液置于冰浴中，加入預冷的丙酮，攪拌15-30min，于3_4°C， 4500-10000r/min冷凍離心15-20min，棄上清液，用緩沖液溶解沉淀，再透析緩沖液，收集 透析液，于3-4°C下靜置一夜；(5)將靜置一夜的透析液在3-4°C下、5000-20000r/min冷凍離心10_12min，收集上清液，3-4°C低溫保存。(6)將步驟(5)收集的上層清液采用截留分子量為17000-18000道爾頓的中空纖 維膜進行濃縮；(7)將濃縮后的產物進行冷凍真空干燥，得SOD復合酶。所述的從宣木瓜果實中提取SOD復合酶的方法，其特征在于所述的緩沖液為在 IOOml 0. lmol/L的PH 7. 8的磷酸緩沖液中，添加77. OOmg DTT, 5. OOOgPVP，充分混勻所制 得的溶液。本專利技術和已有技術相比具有如下優(yōu)點(1)提取過程完全可控，不受自然環(huán)境的影響(2)提取工藝簡單；(3)提取率高； (4)在提取過程中，最后采用冷凍真空干燥，最大限度保留了木瓜蛋白酶和SOD酶 的活性。宣木瓜資源豐富，宣木瓜果實營養(yǎng)豐富，具有極高的食用價值和營養(yǎng)保健作用，但 由于其酸澀味極少鮮食，目前主要有宣木瓜酒、果醋、果脯、蜜餞等傳統(tǒng)食品，利用率不高。 本專利技術以宣木瓜果實為原料，為綜合利用宣木瓜資源提供理論和實際應用依據(jù)，本專利技術在 工業(yè)化實施后，將對促進宣木瓜產業(yè)發(fā)展、增加果農收入等方面具有積極意義。具體實施例方式現(xiàn)以實驗室實施為例，非限定實施例敘述如下(一 )宣木瓜果實中木瓜蛋白酶的提取取新鮮的宣木瓜果實，清洗去皮、籽后，切塊，取果肉，加入本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步驟：　　（１）將新鮮宣木瓜果實洗凈，去皮、去籽；　　（２）向步驟（１）處理過的果實里加蒸餾水進行研磨勻漿；　　（３）將步驟（２）的研磨勻漿采用超聲提取，通過冰浴的方法控制超聲溫度為４－１２℃；　　（４）將經過超聲提取過的漿料用離心機冷凍離心分離，溫度為３－５℃，離心機的轉速為６０００－１００００ｒ／ｍｉｎ；　　（５）將離心所得的上層清液采用２００－６００目的篩網(wǎng)及孔徑為５μｍ的袋式過濾器進行粗過濾，去除宣木瓜果漿中的雜質及不溶性成分，得到粗酶液；　　（６）將粗酶液采用截留分子量為９０００－１００００道爾頓的超濾膜超濾，分離小分子雜質，得到超濾產物；　　（７）將超濾后的產物進行冷凍真空干燥，得木瓜蛋白酶。

【技術特征摘要】
一種從宣木瓜果實中提取木瓜蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將新鮮宣木瓜果實洗凈，去皮、去籽；(2)向步驟(1)處理過的果實里加蒸餾水進行研磨勻漿；(3)將步驟(2)的研磨勻漿采用超聲提取，通過冰浴的方法控制超聲溫度為4 12℃；(4)將經過超聲提取過的漿料用離心機冷凍離心分離，溫度為3 5℃，離心機的轉速為6000 10000r/min；(5)將離心所得的上層清液采用200 600目的篩網(wǎng)及孔徑為5μm的袋式過濾器進行粗過濾，去除宣木瓜果漿中的雜質及不溶性成分，得到粗酶液；(6)將粗酶液采用截留分子量為9000 10000道爾頓的超濾膜超濾，分離小分子雜質，得到超濾產物；(7)將超濾后的產物進行冷凍真空干燥，得木瓜蛋白酶。2.一種從宣木瓜果實中提取SOD復合酶的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將新鮮宣木瓜果實洗凈，去皮、去籽；(2)向步驟(1)處理過的果實里加入提取緩沖液進行研磨勻漿；(3)將步驟(2)的研磨勻漿采用離心機冷凍離心分離...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：丁之恩，張桂敏，盛俠，任琪，王敏麗，
申請(專利權)人：安徽農業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：34[中國|安徽]