【技術實現步驟摘要】
本專利技術專利涉及一種防污染的多重tngs病原建庫試劑及多重tngs病原擴增方法，屬于生物。
技術介紹
1、防污染的試劑需要用dutp來替換dna的堿基組成dttp,同時試劑中需含有udgase來消化第一輪含dutp的擴增產物的泄露，從而達到防污染的效果。因此t堿基含量高的基因的擴增在防污染的體系中的擴增要差于正常含dttp的試劑。多重tngs建庫試劑是最新推出的高達3000重以上的擴增試劑，為達到較好的臨床檢測的效果，要求試劑對不同的靶標擴增具有較好的均一性，這不僅要求在多重引物設計時需要考慮引物間的相互影響，同時要求試劑擴增不具有基因偏好性。綜合防污染的試劑對不同結構基因的擴增具有偏好性和多重tngs建庫試劑的要求試劑均一性的矛盾點，常規的設計無法滿足一款無偏好性擴增的防污染多重tngs病原建庫試劑的要求。
2、本專利技術通過試劑的巧妙設計和擴增程序設計，創造出一款均一性好的防污染多重tngs病原建庫試劑。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種高生物活性wnt3a融合蛋白的簡便的生產工藝。
2、本專利技術采用的技術方案為：一種防污染的多重tngs病原建庫試劑，包括一輪防污染多重擴增試劑a和二輪防污染多重擴增試劑b；
3、其中一輪防污染多重擴增試劑a包括50-100mm甜菜堿和1％-10％吡咯烷酮、0.1-1uugdase、20mm-40mm?tris-hcl、50-80mm?kcl、3-4mm?mgcl2、5-10u?taq019kh
4、二輪防污染多重擴增試劑b包括20mm-40mm?tris-hcl、50-80mm?kcl、3-4mmmgcl2、5-10utaq019khs、0.05-0.1mm?datp、0.05-0.1mm?dgtp、0.05-0.1mm?dctp、0.05-0.2mm?dutp。
5、本專利技術還公開了一種防污染的多重tngs病原擴增方法，其步驟包括：
6、(1)以檢測樣本為模板，在前述的一輪防污染多重擴增試劑a和多重引物的作用下進行第一輪pcr擴增；
7、(2)以第一輪pcr擴增產物為模板，添加p5接頭和p7引物,在前述的二輪防污染多重擴增試劑b的作用下進行接頭連接和第二輪pcr擴增。
8、多重引物采用現有的多重tngs的引物即可，比如yeasen?13592的多重引物，接頭和引物可以采用yeasen?12412試劑盒中的接頭和引物，第二輪擴增完成后即可直接上機測序。
9、優選的，步驟(1)中在第一輪擴增前，反應體系先在ugdase反應溫度下放置5min，以消化環境中的含u產物。
10、優選的，步驟(1)中，每25ul反應體系中包括一輪防污染多重擴增試劑a?6.26ul，多重擴增primer?mix?2-3ul，模板10ng，余量為h20。
11、優選的，步驟(1)中的第一輪擴增反應程序為：
12、
13、優選的，步驟(1)和(2)之間還包括步驟(1’):對第一輪擴增的pcr產物進行純化。
14、優選的，步驟(2)中，每25ul反應體系中包括二輪防污染多重擴增試劑b12.5ul，p50x?1ul，p70x?1ul，第一輪pcr擴增產物10ng，余量為h20。
15、優選的，步驟(2)的第一輪擴增反應程序為：
16、
17、優選的，步驟(2)之后還包括步驟(2’):對第二輪擴增的pcr產物進行純化。
18、普通的防污染多重tngs建庫試劑往往在一輪擴增試劑中同時添加udg和dutp，雖然滿足了防污染的效果，但往往會犧牲文庫的擴增均一性。本專利技術提供了一種防污染的多重tngs病原建庫試劑，一輪擴增試劑含udg,以消化含u的文庫的氣溶膠污染，二輪擴增試劑含dutp,制備出含u的擴增文庫；本專利技術將udg和dutp分開添加，既可以滿足防污染的效果，同時試劑的擴增均一性可以達到普通的不含防污染效果的試劑的均一性。
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1.一種防污染的多重tNGS病原建庫試劑，其特征在于包括一輪防污染多重擴增試劑A和二輪防污染多重擴增試劑B；
2.一種防污染的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于其步驟包括：
3.根據權利要求2所述的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于步驟(1)中在第一輪擴增前，反應體系先在UGDase反應溫度下放置5-10min。
4.根據權利要求2所述的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于步驟(1)中，每25ul反應體系中包括一輪防污染多重擴增試劑A?6.26ul，多重擴增Primer?mix?2-3ul，模板10ng，余量為H20。
5.根據權利要求4所述的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于步驟(1)中的第一輪擴增反應程序為：
6.根據權利要求2所述的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于步驟(1)和(2)之間還包括步驟(1’):對第一輪擴增的PCR產物進行純化。
7.根據權利要求2所述的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于步驟(2)中，每25ul反應體系中包括二輪防污染多重擴增試劑B12.5ul，P50x?1ul，P
8.根據權利要求7所述的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于步驟(2)的第一輪擴增反應程序為：
9.根據權利要求2所述的多重tNGS病原擴增方法，其特征在于步驟(2)之后還包括步驟(2’):對第二輪擴增的PCR產物進行純化。
...【技術特征摘要】
1.一種防污染的多重tngs病原建庫試劑，其特征在于包括一輪防污染多重擴增試劑a和二輪防污染多重擴增試劑b；
2.一種防污染的多重tngs病原擴增方法，其特征在于其步驟包括：
3.根據權利要求2所述的多重tngs病原擴增方法，其特征在于步驟(1)中在第一輪擴增前，反應體系先在ugdase反應溫度下放置5-10min。
4.根據權利要求2所述的多重tngs病原擴增方法，其特征在于步驟(1)中，每25ul反應體系中包括一輪防污染多重擴增試劑a?6.26ul，多重擴增primer?mix?2-3ul，模板10ng，余量為h20。
5.根據權利要求4所述的多重tngs病原擴增方法，其特征在于步驟(1)中的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫曉亮，馬海玲，曹振，
申請(專利權)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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