【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬基因工程，涉及一種電轉緩沖液、電轉化方法及其應用。
技術介紹
1、2020年，通過系統發育學和比較基因組分析對17個不同的芽孢桿菌屬進行進一步的劃分，普里斯特氏菌(priestia)屬成為了芽孢桿菌科新屬。在最新的分類表中普里斯特氏菌屬下劃分有10個子類群，其中巨大普里斯特氏菌(priestia?megaterium)便是其中之一。巨大普里斯特氏菌，是一種好氧革蘭氏陽性菌，具有對環境友好、對糧食作物安全、對人畜無害等優點，廣泛應用于解磷固氮、生物防治、水體凈化等領域，是極具應用價值的微生物資源。巨大普里斯特氏菌生長迅速、生物合成及代謝途徑豐富，可作為細胞工廠進行生物發酵，表現出良好的生產潛力。
2、用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的細菌類細胞株系一般稱為“工程菌”(基因工程菌)。通過這種改造，得到的“工程菌”在實際使用領域具有更大應用價值。但這種改造根據不同的改造菌種(受體細菌，受體菌)而呈現出不同的難度。細菌轉化是構建“工程菌”的重要方式。受體細菌通過直接吸收來自供體細菌或人工重組的含有特定基因的dna片段，從而獲得了相應遺傳性狀，這種現象稱為細菌轉化。常用的轉化細菌的方法包括化學轉化、電轉化、熱激轉化等。其中，電轉化則是利用電場作用，使dna分子穿過細胞膜進入細胞內。這一技術能夠大大提高細胞對外源dna的吸收效率，是常用的細胞轉染方法之一。在實際操作中，首先將目標細胞與外源dna置于緩沖液中，然后施加脈沖電場，使細胞膜暫時變得通透，從而促進dna進入細胞。
3、目前，現有技術中普里
技術實現思路
1、針對上述問題，本專利技術在對普里斯特氏菌及其電轉化方法的深入研究和探索中，得到了一種全新的電轉緩沖液，以及基于該電轉緩沖液的電轉化方法及其應用。
2、第一方面，本專利技術提供了一種電轉緩沖液，該電轉緩沖液的主要成分包括：可溶性糖和ph值大于等于4且小于等于6的無機鹽。
3、進一步的，該電轉緩沖液還包括甘油。
4、第二方面，本專利技術提供了一種電轉化方法，該電轉化方法中采用第一方面的電轉緩沖液。
5、第三方面，本專利技術提供了第一方面的電轉緩沖液和第二方面的電轉化方法在工程菌制備中的應用。
6、在本專利技術的一種具體實施方式中，上述工程菌為普里斯特氏菌。
7、第四方面，本專利技術提供了一種普里斯特氏菌電轉化方法，包括：取普里斯特氏菌感受態細胞，加入質粒dna，冰浴后加入第一方面提供的電轉化緩沖液，冰浴后轉入預冷的電擊杯中進行電擊。
8、進一步的，在本專利技術的一種具體實施方式中，上述普里斯特氏菌感受態細胞的制備包括以下步驟：a、將普里斯特氏菌在固體培養基平板上劃線培養；b、挑取單克隆接種于液體培養基，置于37℃搖床過夜培養；c、轉接過夜培養物至液體培養基，置于37℃搖床培養；d、分裝培養物至無菌離心管，冰浴后4℃離心收集菌體；e、將d步驟后收集的菌體用無菌水進行重懸，再冰浴離心收集菌體，此步驟重復若干次；f、將e步驟后收集的菌體用甘油溶液進行重懸，冰浴后離心收集菌體，此步驟重復若干次；g、將f步驟后收集的菌體用甘油溶液進行重懸，分裝保存，得到普里斯特氏菌感受態細胞。
9、在本專利技術的一種具體實施方式中，上述普里斯特氏菌電轉化方法中，在電擊后，迅速于電擊杯中加入液體培養基，充分混勻后轉移至無菌離心管，置于37℃搖床孵育；將孵育后的轉化細胞培養液涂布于含載體抗性的抗生素篩選平板上，37℃倒置培養。
10、第五方面，本專利技術提供了一種通過上述方法制備得到的工程菌，該工程菌為包含有噬菌體裂解系統基因的巨大普里斯特氏菌。
11、本專利技術的有益效果在于：本專利技術提供的電轉化緩沖液不同于現有技術中常見的電轉緩沖液，該緩沖液在電擊時能最大限度降低細胞死亡率，同時確保高效的核酸遞送，尤其是在普里斯特氏菌的電轉化中使轉化效率增長22倍，解決了現有技術中普里斯特氏菌轉化困難的問題。
12、本專利技術提供的電轉緩沖液、電轉化方法，為菌種改造提供了全新的技術支持，將其應用于工程菌領域所獲得的菌體能夠應用于例如噬菌體裂解酶等外源基因誘導表達等研究，大大拓展普里斯特氏菌的生物學應用。
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1.一種電轉緩沖液，其特征在于，所述電轉緩沖液包括：可溶性糖和pH值大于等于4且小于等于6的無機鹽。
2.根據權利要求1所述的電轉緩沖液，其特征在于，所述可溶性糖包括單糖和雙糖中的至少一種；
3.根據權利要求1所述的電轉緩沖液，其特征在于，所述無機鹽為磷酸的酸式鹽；
4.根據權利要求1所述的電轉緩沖液，其特征在于，所述電轉緩沖液還包括甘油。
5.一種電轉化方法，其特征在于，所述電轉化方法中采用如權利要求1-4中任一項所述的電轉緩沖液。
6.如權利要求1-4所述的電轉緩沖液或如權利要求5所述的電轉化方法在工程菌制備中的應用。
7.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述工程菌為普里斯特氏菌；
8.一種普里斯特氏菌電轉化方法，包括：取普里斯特氏菌感受態細胞，加入質粒DNA，冰浴后加入如權利要求1-4中任一項所述的電轉化緩沖液，冰浴后轉入預冷的電擊杯中進行電擊。
9.如權利要求8所述的電轉化方法，其特征在于，所述感受態細胞的制備包括以下步驟：a、將普里斯特氏菌在固體培養基平板上劃線培養；b、
10.一種通過如權利要求5或8所述的電轉化方法制備得到的工程菌，所述工程菌為包含有噬菌體裂解系統基因的巨大普里斯特氏菌。
...【技術特征摘要】
1.一種電轉緩沖液，其特征在于，所述電轉緩沖液包括：可溶性糖和ph值大于等于4且小于等于6的無機鹽。
2.根據權利要求1所述的電轉緩沖液，其特征在于，所述可溶性糖包括單糖和雙糖中的至少一種；
3.根據權利要求1所述的電轉緩沖液，其特征在于，所述無機鹽為磷酸的酸式鹽；
4.根據權利要求1所述的電轉緩沖液，其特征在于，所述電轉緩沖液還包括甘油。
5.一種電轉化方法，其特征在于，所述電轉化方法中采用如權利要求1-4中任一項所述的電轉緩沖液。
6.如權利要求1-4所述的電轉緩沖液或如權利要求5所述的電轉化方法在工程菌制備中的應用。
7.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述工程菌為普里斯特氏菌；
8.一種普里斯特氏菌電轉化方法，包括：取普里斯特氏菌感受態細胞，加入質粒dna，冰...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃藝，白歆奕，張廣豹，張夢君，
申請(專利權)人：北京大學深圳研究院，
類型：發明
國別省市：
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