白細(xì)胞介素６基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開一種白細(xì)胞介素６基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，其步驟如下：（１）白細(xì)胞介素６（ＩＬ－６）基因片段的擴(kuò)增；（２）重組ｐＳＥＢ－ｒＩＬ６逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；（３）重組ｐＳＥＢ－ｒＩＬ６逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)功能的測定。本發(fā)明專利技術(shù)所構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒ｐＳＥＢ－ＩＬ６質(zhì)粒可作為真核表達(dá)載體，能夠感染多種類型的細(xì)胞，既可以應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，也可以用于整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用范圍廣，感染效率高；所采用的載體－逆轉(zhuǎn)錄病毒是改造后的一種安全的病毒，該載體不僅帶有組蛋白標(biāo)簽，實(shí)時(shí)檢測表達(dá)水平；而且可以整合入宿主細(xì)胞中，隨著細(xì)胞的不斷分裂而持續(xù)表達(dá)；構(gòu)建過程中所需設(shè)備要求不高，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的理化性質(zhì)穩(wěn)定，在制備、儲存和應(yīng)用過程中簡單易行，適合推廣應(yīng)用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于基因工程，具體涉及一種可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定且高效表達(dá)的白細(xì)胞介素6 (interleukin-6, IL-6)基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
白細(xì)胞介素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子。由于最初是由 白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用，所以由此得名。白細(xì)胞介素interleukin縮寫為IL。 白細(xì)胞介素6 (以下縮寫為IL-6)可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì) 胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等。人類IL-6基因位于 第7號染色體上；IL-6分子量在21 30kd之間，其差異是由于肽鏈的糖基化和磷酸程度 不同所致。IL-6是以單體形式存在，主要功能為刺激細(xì)胞成長、促進(jìn)細(xì)胞分化，對維持機(jī)體 生理平衡具有重要作用。IL-6作用的靶細(xì)胞很多，包括巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、靜止的T淋巴細(xì)胞、活化的B淋巴 細(xì)胞和漿細(xì)胞等；其生物效應(yīng)是①促進(jìn)T淋巴細(xì)胞表面IL-2R的表達(dá)，增強(qiáng)IL-I(即白細(xì)胞介素1)和TNF (腫瘤壞 死因子)對T輔助細(xì)胞的有絲分裂作用；②作為肝細(xì)胞刺激因子，在感染或外傷引起的急性炎癥反應(yīng)中，誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白 的合成，其中以淀粉狀蛋白a和C-反應(yīng)蛋白增加尤為明顯；③促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體；多發(fā)性骨髓瘤的惡變B淋巴細(xì)胞既能產(chǎn)生 IL-6，又能對IL-6發(fā)生應(yīng)答，提示IL-6可能作為這些細(xì)胞的自分泌性生長因子；④IL-6還能有效地促進(jìn)TNF和IL-I誘導(dǎo)的惡病質(zhì)；促進(jìn)糖皮質(zhì)激素合成；刺激破骨 細(xì)胞活性和角質(zhì)細(xì)胞生長；還能促進(jìn)骨髓造血的功能。IL-6不能刺激相應(yīng)細(xì)胞分泌其它細(xì)胞因子，在生理濃度下對免疫細(xì)胞的自分泌作 用亦比較弱，其主要免疫學(xué)功能是加強(qiáng)其它細(xì)胞因子的效果。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因gag_編碼病毒衣殼、基質(zhì)等結(jié)構(gòu) 蛋白的基因；Pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(p66/p51)、蛋白水解酶和整合酶；env-編碼gpl20和gp41 兩種包膜糖蛋白。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下可使RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，整合到宿主細(xì)胞基因組中，并 隨著宿主細(xì)胞中的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增。近年來隨著基因工程的不 斷發(fā)展，已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒，使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，特別是動(dòng)物基 因克隆載體。其最重要的一點(diǎn)是它可以有效的整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶 的外源基因。病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因組不會發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基 因也不會改變。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的寄主范圍相當(dāng)廣泛，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋 巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等，其中有的還能夠在人體細(xì)胞中生長；而且逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感 染效率高，所感染的細(xì)胞不會產(chǎn)生病變導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡。目前市場上銷售的多為純化 的重組IL-6細(xì)胞因子，價(jià)格非常昂貴，若用于動(dòng)物體內(nèi)，則以每公斤微克量來計(jì)算，一只成 年大鼠體內(nèi)注射IL-6平均需要花上百元，因此，有必要構(gòu)建重組質(zhì)粒來滿足科學(xué)研究的不斷需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供，該方法 對設(shè)備要求不高，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的理化性質(zhì)穩(wěn)定，在制備、儲存和應(yīng)用過程中簡單易行， 適合推廣應(yīng)用；得到的白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染多種類型的細(xì)胞， 既可以應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，也可以用于整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用范圍廣，感染效率高；而且 價(jià)格較低。本專利技術(shù)所述的，其步驟如下(1)白細(xì)胞介素6(IL-6)基因片段的擴(kuò)增；通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cDNA為模板，分 別在上游引物的5’端和下游引物3’端設(shè)計(jì)HinD III和BamH I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(斜 體下劃線為酶切位點(diǎn))，即上游引物 5’ -ATC AAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC-3 ’上游引物 5’ -CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC-3，touch down PCR擴(kuò)增獲得IL6目的基因片段rIL6，其序列為atgaagtttctctccgcaagagacttccagccagttgccttcttgggactgatgttgttgacagccactgcc ttccctacttcacaagtccggagaggagacttcacagaggataccacccacaacagaccagtatataccacttcaca agtcggaggcttaattacatatgttctcagggagatcttggaaatgagaaaagagttgtgcaatggcaattctgatt gtatgaacagcgatgatgcactgtcagaaaacaatctgaaacttccagaaatacaaagaaatgatggatgcttccaa actggatataaccaggaaatttgcctattgaaaatctgctctggtcttctggagttccgtttctacctggagtttgt gaagaacaacttacaagataacaagaaagacaaagccagagtcattcagagcaatactgaaaccctagttcatatct tcaaacaagagataaaagactcatataaaatagtccttcctaccccaacttccaatgctctcctaatggagaagtta gagtcacagaaggagtggctaaggaccaagaccatccaactcatcttgaaagcacttgaagaatttctaaaggtcac tatgaggtctactcggcaaacctag(2)重組pSEB-rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；采用PSEB逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有組蛋白標(biāo)簽、hEFH啟動(dòng)子及開放讀碼框 (ORP) ；hEra啟動(dòng)子可有效啟動(dòng)插入ORP中靶基因的高效表達(dá)，同時(shí)3組6個(gè)連續(xù)組蛋白 可以作為檢測標(biāo)簽，反映ORP中插入靶基因的表達(dá)水平；將步驟(1)中所獲得的基因片段 rIL6的PCR產(chǎn)物及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSEB_3H分別經(jīng)HinD III和BamH I雙酶切，連接轉(zhuǎn)化進(jìn) 入DH2a感受態(tài)菌中，通過氨芐青霉素篩選單克隆，獲得具有IL-6重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒 pSm-IL6，并進(jìn)行PCR、雙酶切及序列鑒定；(3)重組pSEB-rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)功能的測定；針對步驟(2)所獲得正確序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-IL6質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將步驟(2)中所獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-IL6質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到大鼠嗜 鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平測定IL-6的表達(dá)水平。本專利技術(shù)的有益效果是(1)本專利技術(shù)所構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒PSEB-IL6質(zhì)粒可作為真核表達(dá)載體，能夠感染多種類 型的細(xì)胞，既可以應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，也可以用于整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用范圍廣，感染效率聞；(2)本專利技術(shù)所采用的載體_逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種改造后的安全病毒，該載體不僅帶有組 蛋白標(biāo)簽，實(shí)時(shí)檢測表達(dá)水平；而且可以整合入宿主細(xì)胞中，隨著細(xì)胞的不斷分裂而持續(xù)表 達(dá)；(3)可以本專利技術(shù)為工具，為研究IL-6的免疫調(diào)節(jié)功能及其相關(guān)信號通路提供有用工具。(4)本專利技術(shù)的構(gòu)建方法所需設(shè)備要求本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
白細(xì)胞介素６基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，其步驟如下：　　（１）白細(xì)胞介素６（ＩＬ－６）基因片段的擴(kuò)增；　　通過逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ｃＤＮＡ為模板，分別在上游引物的５’端和下游引物３’端設(shè)計(jì)ＨｉｎＤⅢ和ＢａｍＨⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（斜體下劃線為酶切位點(diǎn)），即　　上游引物５’－　ＡＴＣＡＡＧＣＴＴ　ＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣ　ＡＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＣＧＣ－　３’　　上游引物５’　－ＣＧＴ　ＧＧＡＴＣＣ　ＧＧＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＧＡＣＣＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣ－３’　　ｔｏｕｃｈ　ｄｏｗｎ　ＰＣＲ擴(kuò)增獲得ＩＬ－６目的基因片段ｒＩＬ６；　　（２）重組ｐＳＥＢ－ｒＩＬ６逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；　　采用ｐＳＥＢ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，　該系統(tǒng)具有組蛋白標(biāo)簽、ｈＥＦＨ啟動(dòng)子及開放讀碼框（ＯＲＰ）；ｈＥＦＨ啟動(dòng)子可有效啟動(dòng)插入ＯＲＰ中靶基因的高效表達(dá)，同時(shí)３組６個(gè)連續(xù)組蛋白可以作為檢測標(biāo)簽，反映ＯＲＰ中插入靶基因的表達(dá)水平；將步驟（１）中所獲得的基因片段ｒＩＬ６的ＰＣＲ產(chǎn)物及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體ｐＳＥＢ－３Ｈ分別經(jīng)ＨｉｎＤⅢ和ＢａｍＨⅠ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化進(jìn)入ＤＨ２ａ感受態(tài)菌中，通過氨芐青霉素篩選單克隆，獲得具有ＩＬ－６重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒ｐＳＥＢ－ＩＬ６，并進(jìn)行ＰＣＲ、雙酶切及序列鑒定；　　（３）重組ｐＳＥＢ－ｒＩＬ６逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)功能的測定；　　針對步驟（２）所獲得正確序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒ｐＳＥＢ－ＩＬ６質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將步驟（２）中所獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒ｐＳＥＢ－ＩＬ６質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤ＰＣ１２細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞ＨＥＫ２９３中，ｍＲＮＡ水平和蛋白水平測定ＩＬ－６的表達(dá)水平。...

【技術(shù)特征摘要】
白細(xì)胞介素6基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，其步驟如下(1)白細(xì)胞介素6(IL 6)基因片段的擴(kuò)增；通過逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)(RT PCR)方法，以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cDNA為模板，分別在上游引物的5’端和下游引物3’端設(shè)計(jì)HinDⅢ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(斜體下劃線為酶切位點(diǎn))，即 上游引物5’ ATCAAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC 3’上游引物5’ CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC 3’touch down PCR擴(kuò)增獲得IL 6目的基因片段rIL6；(2)重組pSEB rIL6逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；采用pSEB逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng), 該系統(tǒng)具有組蛋白標(biāo)簽、hEFH啟動(dòng)子及開放讀碼框(ORP)；h...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳潔，張贇，畢楊，龔敏，李廷玉，魏小平，孫五慶，
申請(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：85[中國|重慶]