【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學領域，涉及自體干細胞培養液，尤其涉及自體干細胞培養液及其在修復女性生殖器官凝膠上的應用。
技術介紹
1、女性生殖系統器官及組織結構的完整和功能的正常對于女性健康至關重要。女性生殖系統疾病是由多種因素引起生殖器官結構受損、功能障礙，進而導致生殖能力減弱甚至喪失。近年來，干細胞與生物材料為女性生殖系統疾病的治療帶來新的希望。間充質干細胞具有高度增殖、自我更新能力和多向分化潛能，可通過多種機制修復受損生殖器官，改善生殖功能，恢復生育能力。
2、間充質干細胞(mscs)最早是從人的骨髓中分離、培養獲得，由于免疫原性較低，使mscs成為組織工程的種子細胞之一。胎盤來源的mscs是從胎兒蛻膜側胎盤分離而來，屬于早期來源、有更高的傳代和分化能力的細胞，具有更高的擴增能力。由于其來源廣、免疫原性低、病毒污染率較低、不存在倫理爭議等優點，目前pmscs已經成為基礎研究和臨床應用的一個非常具有吸引力的替代細胞。胎盤間充質干細胞能分泌許多細胞因子，改善卵巢局部微環境，使b淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)蛋白表達顯著上調。間充質干細胞具有高度增殖、自我更新能力和多向分化潛能，可通過多種機制修復受損生殖器官，改善生殖功能，恢復生育能力。負載外泌體的水凝膠可以促進細胞的遷移，顯著加速創面的愈合和膠原纖維的沉積，另一方面，通過細胞外基質水凝膠增加損傷處外泌體的局部濃度和保留度。水凝膠作為一種生物材料，可模擬組織修復和再生所需的環境，增強生物學活性，修復受損組織，在生殖系統修復方面具有廣闊的應用前景。
3、本專利技
技術實現思路
1、針對以上問題，本專利技術選擇在完全培養基中加入改性枸杞多糖、改性黃芪甲苷、與加入的血紅蛋白，轉鐵蛋白和成纖維生長因子，協同促進干細胞的增殖，并延緩干細胞在培養過程中的老化現象。并且將甲基丙烯酸改性透明質酸水凝膠能夠有效建立一個免疫隔離屏障，顯著增強移植外泌體的穩定性，使制備的水凝膠應用于女性生殖系統疾病中。本專利技術采用的具體步驟如下：
2、第一方面的，本專利技術提供了一種安全培養基，具體制備步驟如下：
3、s1、改性枸杞多糖：取枸杞多糖(購買于山東新雄生物科技有限公司)0.2～0.8g加入適量水溶解，用0.5mol/l?naoh溶液調節ph至9～10，邊攪邊分批量加入乙酸酐試劑，始終維持ph在8～10范圍內，恒溫反應一段時間。反應完畢后，用0.5mol/l?hcl調節ph為7～8，之后將溶液轉入3000da的透析袋中，透析40～50h，經真空冷凍干燥即為改性的枸杞多糖。該步驟中，將枸杞多糖進行乙?；揎?，乙?；〈髓坭蕉嗵擎溕系牧u基，改性后的枸杞多糖較改性前抗氧化能力明顯提升，并且具有一定的抑菌能力。
4、s2、改性黃芪甲苷：稱取黃芪甲苷(購買于陜西斯諾特生物技術有限公司)10～20g，將其與0.4～0.5g/ml魔芋膠和溶于體積分數為3％的冰醋酸溶液中的10～20g殼聚糖相混合。置于50～60℃鼓風干燥箱中烘干2～4h，得到改性的黃芪甲苷。該步驟以黃芪甲苷和殼聚糖為材料，魔芋膠為絮凝劑，制備出改性的黃芪甲苷，這樣得到的黃芪甲苷不僅保持原有的促進細胞生理代謝的作用，而且可以吸附血紅蛋白使其為干細胞轉運氧氣。
5、s3、完全培養基配置：使用超速離心機將血清在4℃下以120000r/min超速離心12h，以制備不含外泌體的血清；在生物安全柜中將90～95ml不含外泌體的血清和5～10ml抗菌素加入400ml低糖改良伊格爾培養基中，再加入添加步驟s1制備的改性枸杞多糖、步驟s2制備的改性黃芪甲苷攪拌均勻50～60min，再將血紅蛋白，轉鐵蛋白和成纖維細胞生長因子加入并攪拌均勻20～30min，最后加入維生素d，其中5ml抗菌素中含青霉素、鏈霉素、兩性霉素b質量比為1：10：2，改性枸杞多糖、改性黃芪甲苷、血紅蛋白、轉鐵蛋白、成纖維細胞生長因子和維生素d質量比為8：4：3：1：1：1，其中維生素d加入的質量為10g；混勻后置于2～8℃冰箱中，即得自體干細胞培養液，一個月內用完。該步驟中枸杞多糖具有抗氧化作用，降低干細胞的氧分壓，促進細胞因子生活，與黃芪甲苷搭配可進一步促進細胞的生長于增殖。血紅蛋白為干細胞轉運氧氣；轉鐵蛋白通過與細胞表面受體結合轉運鐵元素，調節細胞內鐵元素的代謝；成纖維細胞生長因子具有促進修復和再生的作用，適量的加入維生素d可調節細胞生長分化。改性的黃芪甲苷吸附血紅蛋白，培養基中加入的血紅蛋白，轉鐵蛋白和成纖維生長因子，與枸杞多糖和黃芪甲苷協同促進干細胞的增殖，并延緩干細胞在培養過程中的老化現象。
6、第二方面的，本專利技術提供了獲取胎盤干細胞外泌體方法，具體制備步驟如下：
7、s4、采用差速超速離心方案獲取胎盤干細胞外泌體：取第2～4代胎盤干細胞(購買于賽業生物科技，貨號：yx-10089)用于培養分離外泌體，當細胞密度達到80～85％時，換用無外泌體步驟s3中制備的完全培養基中，即換用上述所得的自體干細胞培養液，48～50h后收集細胞上清液。將上清液低速離心(2000r/min，20min)去除死細胞和細胞碎片后，使用0.22～0.3μm濾頭進行過濾，繼續進行高速離心(100?000r/min，90min)。離心后的內容物用pbs洗滌，再次高速離心(100?000r/min，90min)得到外泌體，將200～400μg干燥的外泌體重新懸浮在100～200μlpbs中得到外泌體溶液以備進一步使用。該步驟中，外泌體是細胞分泌的直徑為40～140nm的微小囊泡，具有非免疫性和非致瘤性等優點。胎盤干細胞外泌體含有多種mrna、脂質和蛋白質等多種生物活性物質，具有抗炎和促進細胞增殖生長的作用。
8、第三方面的，本專利技術提供了負載干細胞外泌體的水凝膠，即女性生殖器官修復凝膠，具體制備步驟如下：
9、s5、女性生殖器官修復凝膠的制備：將20～40ml?20％甲基丙烯酸酐溶液(水溶液)加入4～8g透明質酸溶液中，攪拌反應1～2h，制備成混合溶液，3000da透析袋透析后冷凍干燥保存即得甲基丙烯酸化透明質酸水凝膠溶液。將200～250μg步驟s4的外泌體溶液和0.05％苯基-2，4，6-三甲基苯甲?；戊⑺徜嚰尤氲缴鲜黾谆┧峄该髻|酸水凝膠溶液中均勻攪拌后放入4～5℃冷藏12～18h使凝膠充分溶脹。將混合溶液在紫外光(uv)下交聯形成負載外泌體的甲基丙烯酸化透明質酸水凝膠。該步驟中甲基丙烯酸改性透明質酸水凝膠能夠有效建立一個免疫隔離屏障，顯著增強移植外泌體的穩定性，提供了一種高效且有效的方式來維持外泌體的生物活性，使制備的水凝膠在修復女性生殖器官上具有良好的效果，該水凝膠具有高彈性、高透氣性、無毒以及良好的力學性能的優勢，可作為理想的細胞運輸載體。
10、優選地：所述步驟s1中取枸杞多糖0.2g加入適量水溶解，用0.5mol/l?naoh溶液調節ph至9；
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【技術保護點】
1.自體干細胞培養液，其特征在于：具體制備步驟如下：
2.根據權利要求1所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟S1中取枸杞多糖0.2g加入適量水溶解，用0.5mol/L?NaOH溶液調節pH至9。
3.根據權利要求2所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟S1中用0.5mol/LHCl調節pH為7，之后將溶液轉入3000Da的透析袋中，透析40h。
4.根據權利要求1所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟S2中稱取黃芪甲苷10g。
5.根據權利要求1所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟S3中在生物安全柜中將90mL胎牛血清和5mL抗菌素加入400mL低糖改良伊格爾培養基中。
6.干細胞外泌體，其特征在于：所述干細胞外泌體是將第2～4代胎盤干細胞在權利要求1-5任一項所述自體干細胞培養液中培養制得。
7.根據權利要求6所述的干細胞外泌體，其特征在于：采用差速超速離心方案獲取胎盤干細胞外泌體，具體為：取第2～4代胎盤干細胞用于培養分離外泌體，當細胞密度達到80～85％時，換用步驟S3中制備
8.權利要求6-7任一項所述的干細胞外泌體在修復女性生殖器官凝膠上的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：干細胞外泌體用于制備女性生殖器官修復凝膠的具體步驟如下：
10.根據權利要求9所述的自體干細胞培養液在修復女性生殖器官凝膠上的應用，其特征在于：所述步驟S5中將20ml?20％甲基丙烯酸酐溶液(水溶液)加入4g透明質酸溶液中。
...【技術特征摘要】
1.自體干細胞培養液，其特征在于：具體制備步驟如下：
2.根據權利要求1所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟s1中取枸杞多糖0.2g加入適量水溶解，用0.5mol/l?naoh溶液調節ph至9。
3.根據權利要求2所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟s1中用0.5mol/lhcl調節ph為7，之后將溶液轉入3000da的透析袋中，透析40h。
4.根據權利要求1所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟s2中稱取黃芪甲苷10g。
5.根據權利要求1所述的自體干細胞培養液，其特征在于：所述步驟s3中在生物安全柜中將90ml胎牛血清和5ml抗菌素加入400ml低糖改良伊格爾培養基中。
6.干細胞外泌體，其特征在于：所述干細胞外泌體是將第2～4...
【專利技術屬性】
技術研發人員：宮本清男，
申請(專利權)人：杏林醫學科技江蘇有限公司，
類型：發明
國別省市：
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