【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于核型分析，特別是涉及一種外周血染色體核型分析顯帶方法及其應用。
技術介紹
1、染色體高分辨核型分析顯帶技術往往被認為是診斷染色體畸形的金標準，而顯帶水平對染色體診斷占有舉足輕重的地位。國內外學者為了追求更高的顯帶技術不斷進行實驗方法改良。
2、正常情況下，人體外周血中是沒有分裂相的，只有在異常情況下才能發現分裂相，在有絲分裂刺激物(如pha植物抗凝素)作用下，使原處于g0周期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，進而進行有絲分裂。利用這一特性，淋巴細胞經過培養，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細胞群，當細胞增殖到一定數量時，加入5-氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷從而抑制dna的合成，將其同步在細胞s期，同時作用17小時后加入胸腺嘧啶核苷(tdr)釋放細胞，使細胞有絲分裂繼續，進入分裂期后加入染色體縮短抑制劑溴化乙錠(eb)，作用1小時后加入秋水仙胺破壞細胞紡錘絲的形成，從而阻止到較多具有550條帶或以上條帶的分裂相，顯現染色體本身更細微的結果，便于進行人類染色體高分辨核型分析。
3、然而，現有方法學檢測檢驗結果回報時間(turn?around?time，tat)時間較長，需加入多種試劑，且部分試劑為劇毒(如溴化乙錠等)，對人體健康帶來危害。
技術實現思路
1、針對上述常規進行高分辨核型分析需要使用劇毒試劑的問題，本專利技術提供一種外周血染色體核型分析顯帶方法，采用該方法進行高分辨核型分析時，可避免使用劇毒試劑，且具有較短的tat。
2、本專利
3、本專利技術人對常規技術中進行高分辨核型分析方法進行了大量調研和摸索，但發現均需要使用劇毒試劑。隨后，專利技術人對細胞分裂周期和核型顯色過程進行了分析，可利用秋水仙胺破壞紡錘絲的作用，再結合胰酶消化達到一定的條帶水平，由此設計了精巧的實驗并進行了驗證，即利用在細胞培養過程中使淋巴細胞成為含有絲分裂的生長活躍的細胞群，加入濃度較低的低滲溶液，既使細胞分散且形態圓整，又極大的提高了細胞膜的通透性，此時在溫浴條件下加入低濃度的秋水仙胺，秋水仙胺可進入細胞內使淋巴細胞進入分裂中期，同時由于此過程中加入的秋水仙胺濃度較低，可免除加入其它如吖啶類試劑等提高細胞穩定性。因而，本專利技術通過使用含有絲分裂的生長活躍的淋巴細胞群，在低滲處理同時加入低濃度的秋水仙胺，即可使淋巴細胞呈現分裂相，避免了有毒試劑的使用，但將低滲處理和秋水仙胺同步處理后分裂指數較高，需嚴格控制低滲濃度和秋水仙胺的濃度。
4、在其中一些實施例中，所述孵育的溫度為36-38℃，和/或，所述孵育的時間為20-25min。上述在低滲處理環境中加入秋水仙胺的條件下，孵育需在細胞生長適宜的溫度進行，且需嚴格控制低滲孵育的時間，時間過短無法達到預期效果，如核型分散性降低或不利于秋水仙胺的作用等，時間過長又可能會對細胞產生不利的影響，控制在上述范圍內，具有較好的處理效果。優選的，所述孵育采用溫水孵育，可較好的控制溫度穩定，提高處理效果。
5、在其中一些實施例中，所述誘導分裂步驟之前，還包括細胞培養步驟，所述細胞培養步驟為：取淋巴細胞培養基，加入抗凝外周血，進行淋巴細胞培養。
6、在其中一些實施例中，所述細胞培養步驟中，所述抗凝外周血為加入肝素的抗凝血。
7、在其中一些實施例中，所述細胞培養步驟中，所述淋巴細胞培養的時間為60-84小時，優選68-72小時，更優選72小時。
8、在其中一些實施例中，所述細胞培養步驟中，細胞培養結束后，離心去除上清，收集淋巴細胞，備用。
9、在其中一些實施例中，所述離心條件為：1500-1900轉/min離心5-10min，優選1700轉離心7min。細胞培養結束后進行離心時，可選用較低的離心轉速，保持細胞的分散性和獨立性，有利于提高后續低滲處理時的效果。
10、在其中一些實施例中，所述誘導分裂步驟之后，還包括依次進行的固定、制片、老化、顯帶步驟，
11、所述固定步驟為：以固定液進行固定，得到淋巴細胞沉淀，優選的，所述固定液為卡諾氏固定液；
12、所述制片步驟為：將上述淋巴細胞以固定液稀釋，滴于玻片后靜置等待核型分散；
13、所述老化步驟為：將上述玻片進行烘烤老化；
14、所述顯帶步驟為：以胰酶進行顯帶消化后加入吉姆薩染液進行染色。
15、可以理解的，上述步驟可按照本領域常規操作即可，具體可根據試驗情況和要求進行調整。
16、在其中一些實施例中，所述誘導分裂步驟中，加入秋水仙胺溶液和氯化鉀溶液后，以軟吸管吹打混勻，優選地，吹打次數為25-30次。
17、在其中一些實施例中，所述固定步驟包括預固定和后固定，所述預固定為：向進入分裂中期的淋巴細胞溶液體系中加入固定液，混勻，離心去除上清液，進行預固定，所述固定液的加入量與所述淋巴細胞溶液體系的體積比為1-2:7；所述后固定為：取預固定后的淋巴細胞，加入固定液，混勻，離心去除上清液，重復1-2次。通過上述預固定和后固定兩部分的配合，通過預固定的作用，使低滲后的細胞能耐受離心過程中的機械損傷，同時還能裂解可能殘留存在的紅細胞。
18、在其中一些實施例中，所述制片步驟中，所述靜置時間為10-20min，優選15min。
19、在其中一些實施例中，所述老化步驟中，所述烘烤條件為在80-95℃烘烤1-2h，優選在90℃烘烤1.5h。
20、在其中一些實施例中，所述顯帶步驟中，將所述玻片浸泡于胰酶溶液中30-60s，所述胰酶溶液的濃度為0.1875mg/ml。
21、在其中一些實施例中，所述固定步驟中，所述離心條件為：2000-2400轉/min離心5-10min，例如2300轉離心7min。上述離心條件比常規固定離心轉速低，是考慮經過低滲孵育處理的細胞穩定性降低，以較為溫和的離心條件，可保證細胞完整性和核型清晰度。
22、可以理解的，上述方法用于非診斷治療目的。
23、另一方面，本專利技術還公開了上述的外周血染色體核型分析顯帶方法在制備用于高分辨核型分析試劑中的應用。
24、另一方面，本專利技術還公開了一種用于高分辨核型分析試劑盒，包括秋水仙胺溶液和氯化鉀溶液，所述秋水仙胺溶液的工作濃度為0.28±0.02μg/ml，所述氯化鉀溶液的工作濃度為0.06±0.01m，優選的，所述秋水仙胺溶液的工作濃度為0.28μg/ml，所述氯化鉀溶液的工作濃度為0.059m。
25、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本專利技術各較佳實例。
26、本專利技術所用試劑和原料均市售可得。
27、本專利技術的積極本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，包括誘導分裂步驟，所述誘導分裂步驟為：取經細胞培養得到的外周血淋巴細胞，加入秋水仙胺溶液和氯化鉀溶液，使溶液體系中秋水仙胺濃度為0.28±0.10μg/ml，氯化鉀濃度為0.06±0.01M，孵育，使淋巴細胞進入分裂中期。
2.根據權利要求1所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述孵育的溫度為36-38℃，和/或，所述孵育的時間為20-25min。
3.根據權利要求1或2所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述誘導分裂步驟之前，還包括細胞培養步驟，所述細胞培養步驟為：取淋巴細胞培養基，加入抗凝外周血，進行淋巴細胞培養。
4.根據權利要求3所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述細胞培養步驟滿足以下至少一種條件：
5.根據權利要求4所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述離心條件為：1500-1900轉/min離心5-10min，優選1700轉/min的轉速離心7min。
6.根據權利要求1或2所述的外周血染色體核型分析顯帶方
7.根據權利要求6所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，滿足以下至少一種條件：
8.根據權利要求7所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述固定步驟中，所述離心條件為：2000-2400轉/min離心5-10min，例如2300轉離心7min。
9.權利要求1-8任一項所述的外周血染色體核型分析顯帶方法在制備用于高分辨核型分析試劑中的應用。
10.一種用于高分辨核型分析試劑盒，其特征在于，包括秋水仙胺溶液和氯化鉀溶液，所述秋水仙胺溶液的工作濃度為0.28±0.02μg/ml，所述氯化鉀溶液的工作濃度為0.06±0.01M，優選的，所述秋水仙胺溶液的工作濃度為0.28μg/ml，所述氯化鉀溶液的工作濃度為0.059M。
...【技術特征摘要】
1.一種外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，包括誘導分裂步驟，所述誘導分裂步驟為：取經細胞培養得到的外周血淋巴細胞，加入秋水仙胺溶液和氯化鉀溶液，使溶液體系中秋水仙胺濃度為0.28±0.10μg/ml，氯化鉀濃度為0.06±0.01m，孵育，使淋巴細胞進入分裂中期。
2.根據權利要求1所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述孵育的溫度為36-38℃，和/或，所述孵育的時間為20-25min。
3.根據權利要求1或2所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述誘導分裂步驟之前，還包括細胞培養步驟，所述細胞培養步驟為：取淋巴細胞培養基，加入抗凝外周血，進行淋巴細胞培養。
4.根據權利要求3所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述細胞培養步驟滿足以下至少一種條件：
5.根據權利要求4所述的外周血染色體核型分析顯帶方法，其特征在于，所述離心條件為：1500-1900轉/min離心5-10min，優...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曾海捷，江帥，陳帆，吳夢華，倫嘉欣，
申請(專利權)人：廣州金域醫學檢驗中心有限公司，
類型：發明
國別省市：
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