【技術實現步驟摘要】
技術介紹
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技術介紹
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1、磷(p)是生物體的基本元素，其以磷酸鹽、磷酸酯或者磷酸酐的形式(主要為+5價氧化態)執行許多基本生物功能1。然而，在非生物系統中磷通常采用-3、0、+3或者+5的氧化態。通常包含3個p-c鍵以及p原子上一個孤對電子的膦配體(p(iii))對于設計和合成可用于眾多重要反應，如suzuki,heck,stille,negishi,buchwald-hartwig偶聯以及不對稱氫化反應的均相催化劑特別有用2。這部分是由于膦配體穩定過渡金屬低氧化態，如pd(0)，有利于金屬中心氧化加成，還原消除和配體交換的獨特能力1a。此外，staudinger連接，重要的生物正交反應，也發生在膦和疊氮之間3。
2、為了彌補非生物膦配體與蛋白化學之間的巨大差異，科學家們已經成功地將膦配體及其金屬復合物在體外插入蛋白中，并創造了新的人工金屬酶(arms)；這是通過共價修飾蛋白側鏈或者通過高親和力錨的非共價連接來實現的4。arms是顯著的混合催化劑，其將蛋白架構的卓越分子識別與人專利技術的過渡金屬或有機催化劑的獨特且多功能的反應性結合5。然而，由于磷配體的氧敏感性，研究人員目前主要通過將已有的膦—過渡金屬催化劑和蛋白直接偶聯和構建arms，該策略可以追溯到1978年wilson和whitesides最早將生物素化的膦-銠催化劑整合入親和素架構6。kamer和laan團隊在惰性氣氛中進行了蛋白半胱氨酸介導的膦配體修飾4a，7。最近，ward和同事報道了使用生物素化的膦-鈀復合物的鏈霉素基arms4b。o
3、盡管在體外進行了這些開創性的工作，構建精簡的體內平臺以實現有氧條件下膦配體位點特異性遺傳整合仍然是艱巨的挑戰。在過去二十年中，有力的遺傳密碼擴展策略(gce)已經使得許多非經典氨基酸(ncaas)在多種生物體中通過翻譯過程被整合入蛋白中，從而產生新的功能蛋白9。通過該策略，我們設想可以創造出結合膦-金屬化學和蛋白設計的新人工金屬酶。
4、為了實現這一目標，必須克服三個挑戰：首先，多數膦配體非常大以至于無法遺傳整合入蛋白中。迄今為止，由于氨酰trna合成酶的底物口袋體積限制，基因編碼的非天然氨基酸最多含有三個芳香環9a。其次，大多數膦配體容易被空氣氧化，而進行氨酰trna合成酶定向進化以促進非天然氨基酸遺傳整合的過程通常在有氧條件下進行；因此，需要膦配體保護策略。最后，由于大多數生物實驗室不配備手套操作箱，金屬偶聯最好能在有氧條件下進行。
技術實現思路
1、為了實現上述目標，一方面，本申請提供了一種基于基因密碼子擴展技術細胞內編碼膦配體設計金屬酶的方法，其特征在于，所述方法中使用結構如下所述的膦配體p3bf：
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3、另一方面，本申請提供了一種用于金屬蛋白設計的基因編碼磷配體p3bf，其結構為：
4、
5、另一方面，本申請提供了一種酪氨酰trna合成酶，其序列為seq?id?no.1。
6、另一方面，本申請提供了上述磷配體p3bf在制備金屬蛋白中的應用。
7、進一步地，上述應用中使用上述酪氨酰trna合成酶。
8、另一方面，本申請提供了向金屬蛋白中引入金屬元素的方法，包括將上述磷配體p3bf遺傳整合入蛋白，以及金屬偶聯的步驟。
9、進一步地，使用基因密碼子擴展技術將上述磷配體p3bf遺傳整合入蛋白，優選通過使用上述酪氨酰trna合成酶將上述磷配體p3bf遺傳整合入蛋白，將上述磷配體p3bf遺傳整合入蛋白的過程優選在大腸桿菌中進行。
10、進一步地，所述金屬蛋白為人工酶。
11、進一步地，所述蛋白為lmrr蛋白，優選同二聚體lmrr蛋白。
12、進一步地，所述lmrr蛋白氨基酸序列為seq?id?no.11，其中15位處的f為p3bf。
13、進一步地，所述lmrr蛋白核苷酸編碼序列為seq?id?no.8。
14、進一步地，所述金屬元素為鈀，優選為鈀環二聚體。
15、進一步地，所述金屬偶聯包括單鍋脫硼步驟，優選所述單鍋脫硼步驟包括將含有p3bf的蛋白與1當量以上，優選1當量的鈀環二聚體孵育。
16、進一步地，所述孵育在dmf水溶液中，有氧條件下進行。
17、另一方面，本申請提供了金屬蛋白，所述金屬蛋白包含膦配體-金屬復合物。
18、進一步地，所述金屬蛋白為人工酶。
19、進一步地，所述膦配體-金屬復合物為p3f金屬復合物，所述p3f為：
20、
21、進一步地，所述人工酶中包括lmrr蛋白，優選同二聚體lmrr蛋白人工酶載體。
22、進一步地，所述lmrr蛋白氨基酸序列為seq?id?no.11，其中15位處的f為p3f。
23、進一步地，所述lmrr蛋白核苷酸編碼序列為seq?id?no.8。
24、本申請還提供了一種包含磷配體的超級折疊熒光蛋白，其氨基酸序列為：seq?idno：5-7，其中第17、3或者9位置處的f為p3bf。
25、進一步地，所述包含磷配體的超級折疊熒光蛋白，其編碼核苷酸序列選自：seq?idno.2-4。
26、本申請中的簡寫或者名稱對應的化學式如下，這些名稱和化學式以及對應化學式的其他命名可以交換使用，表示相同的意思。
27、p3bf：
28、
29、p3f：
30、
31、鈀環(cpd)二聚體：
32、
33、p3f-cpd：
34、
35、本申請開發了一種有效的策略以在大腸桿菌中將p3bf，一種含有硼烷保護的膦的非天然氨基酸定點整合入蛋白。p3bf顯示出良好的生物相容性并在生理環境中保持穩定。這是第一個關于膦配體遺傳納入蛋白的報道。我們以的分辨率解析了含有p3bf的sfgfp的三維結構，這是第一種含p-b鍵的蛋白結構。重要的是，我們開發了在有氧條件下水溶液中實現高效單鍋脫硼和鈀配位的簡單方法。這個有前途的簡便平臺能賦予蛋白以膦配體的非凡化學性質。強有力的基因工程和定向進化策略9f，28現在可以與獨特的膦-金屬化學無縫結合以超出主要配位條件精細調整金屬環境，并能夠合理設計許多新人工金屬酶29。
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1.一種基于基因密碼子擴展技術細胞內編碼膦配體設計金屬酶的方法，其特征在于，所述方法中使用結構如下所述的膦配體P3BF：
2.一種用于金屬蛋白設計的基因編碼磷配體P3BF，其特征在于，所述磷配體P3BF結構為：
3.一種酪氨酰tRNA合成酶，其特征在于，所述酪氨酰tRNA合成酶氨基酸序列為SEQ?IDNO.1。
4.根據權利要求2所述的磷配體P3BF在制備金屬蛋白中的應用。
5.根據權利要求4中所述的應用，其中使用根據權利要求3所述的酪氨酰tRNA合成酶。
6.向蛋白中引入金屬元素的方法，其特征在于，所述方法包括將根據權利要求2所述的磷配體P3BF遺傳整合入蛋白，以及金屬偶聯的步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其中使用基因密碼子擴展技術將磷配體P3BF遺傳整合入蛋白；優選通過使用根據權利要求3所述的酪氨酰tRNA合成酶將磷配體P3BF遺傳整合入蛋白；將磷配體P3BF遺傳整合入蛋白的過程優選在大腸桿菌中進行。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中所述蛋白為人工酶。
9.根據權利要求
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述LmrR蛋白氨基酸序列為SEQ?ID?NO.11，其中15位處的F為P3BF。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述LmrR蛋白核苷酸編碼序列為SEQ?ID?NO.8。
12.根據權利要求7-11任一項所述的方法，其中所述金屬元素為鈀，優選為鈀環二聚體。
13.根據權利要求7-12任一項所述的方法，其中所述金屬偶聯包括單鍋脫硼步驟，優選所述單鍋脫硼步驟包括將含有P3BF的蛋白與1當量以上，優選1當量的鈀環二聚體孵育。
14.根據權利要求13所述的方法，所述孵育在DMF水溶液中，有氧條件下進行。
15.一種金屬蛋白，其特征在于，所述金屬蛋白包含膦配體-金屬復合物。
16.根據權利要求15所述的金屬蛋白，其中所述金屬蛋白為人工酶。
17.根據權利要求15或16所述的金屬蛋白，其中所述膦配體-金屬復合物為P3F金屬復合物，所述P3F為：
18.根據權利要求16或17所述的金屬蛋白，其中所述人工酶中包括LmrR蛋白，優選同二聚體LmrR蛋白人工酶載體。
19.根據權利要求18所述的金屬蛋白，所述LmrR蛋白氨基酸序列為SEQ?ID?NO.11，其中15位處的F為P3F。
20.根據權利要求19所述的金屬蛋白，所述LmrR蛋白核苷酸編碼序列為SEQ?ID?NO.8。
...【技術特征摘要】
1.一種基于基因密碼子擴展技術細胞內編碼膦配體設計金屬酶的方法，其特征在于，所述方法中使用結構如下所述的膦配體p3bf：
2.一種用于金屬蛋白設計的基因編碼磷配體p3bf，其特征在于，所述磷配體p3bf結構為：
3.一種酪氨酰trna合成酶，其特征在于，所述酪氨酰trna合成酶氨基酸序列為seq?idno.1。
4.根據權利要求2所述的磷配體p3bf在制備金屬蛋白中的應用。
5.根據權利要求4中所述的應用，其中使用根據權利要求3所述的酪氨酰trna合成酶。
6.向蛋白中引入金屬元素的方法，其特征在于，所述方法包括將根據權利要求2所述的磷配體p3bf遺傳整合入蛋白，以及金屬偶聯的步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其中使用基因密碼子擴展技術將磷配體p3bf遺傳整合入蛋白；優選通過使用根據權利要求3所述的酪氨酰trna合成酶將磷配體p3bf遺傳整合入蛋白；將磷配體p3bf遺傳整合入蛋白的過程優選在大腸桿菌中進行。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中所述蛋白為人工酶。
9.根據權利要求6-8任一項所述的方法，所述蛋白為lmrr蛋白，優選同二聚體lmrr蛋白。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述lmrr蛋白氨基酸序列為seq?id?...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王江云，胡誠，劉曉紅，
申請(專利權)人：中國科學院生物物理研究所，
類型：發明
國別省市：
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