【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于dna提取試劑盒的，具體涉及一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒的配制與應用。
技術介紹
1、乙型肝炎病毒（hbv）是一種嚴重危害全球人類健康的感染性病毒之一，其可以引起急性和慢性肝臟疾病，如肝炎、肝纖維化、肝衰竭和肝細胞癌等，在肝硬化和肝細胞癌患者中，由hbv感染引起的比例分別為30%和45%，hbv?dna檢測是乙型肝炎病毒感染情況和治療效果的重要指標。
2、當前對hbv?dna提取方法使用的較多的，如苯酚-氯仿法、鹽析法、吸附柱提取法與磁珠提取法。其中，磁珠提取法自動化程度較高，易于普及與推廣，但因為方法學限制，此方案要得到極低濃度的核酸比較困難。cn108570466a公開了一種乙型肝炎病毒核酸提取試劑及其提取方法。包括試劑a、試劑b、試劑c、試劑d與磁性納米顆粒。此專利技術僅公布了提取試劑配制與提取過程，并無實驗數據支持其專利技術可對極低濃度hbv核酸進行有效提取，且試劑中含有毒性物β-巰基乙醇，對實驗人員與環境均存在一定風險。
3、cn103184214a公開了一種乙型肝炎病毒核酸快速提取試劑。其專利技術與羅氏highpure?total?nucleic?acid?kit和臺塑生醫dna/rna萃取試劑盒（磁珠法）進對最低濃度為2.61x102?iu/ml濃度的hbv陽性血漿樣本進行比對，樣本濃度大幅高于hbv?dna超敏檢測下限要求，故無法表明其專利技術能滿足hbv?dna超敏檢測要求。
4、cn102094002a公開了一種提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠、提取試劑、
5、在現有方法中，hbv?dna提取時間在40分鐘~90分鐘，提取時間過長，而對樣本濃度檢測下限至20?iu/ml，而根據aasld?2018版中hbv?dna檢測利用rt-pcr技術，其靈敏度為5-10?iu/ml，因此并不滿足hbv?dna超敏檢測要求，對因此需有一種可實現自動化提取的、快速且高效的hbv?dna提取試劑盒。
6、hbv?dna定量檢測主要用于評估hbv感染者病毒復制水平，是抗病毒治療適應證選擇及療效判斷的重要指標。在抗病毒治療過程中，獲得持續病毒學應答可顯著控制肝硬化進展和降低hcc發生風險。高靈敏度hbv?dna檢測靈敏度更高，線性范圍更廣，特異性更好，能夠縮短hbv檢測的窗口期，更高效地實現對hbv感染的早期診斷，更好地實現早期干預治療和阻斷hbv傳播的目的。因此，高靈敏度hbv?dna檢測在隱匿性hbv感染（obi）篩查、術前hbv檢查、腫瘤患者放、化療后hbv再激活風險評估等方面具有重要的臨床價值。
技術實現思路
1、本針對上述問題，本專利技術的目的在于提供一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒，可依附全自動核酸提取工作站，在30分鐘內，即可從超低濃度hbv樣本中提取出hbv?dna。
2、本專利技術解決技術問題采用如下技術方案：
3、一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒，所述提取試劑的組分包括caiier?rna、蛋白酶k液、磁珠液、裂解結合液、洗滌液1、洗滌液2與洗脫液。
4、所述裂解結合液包括離液鹽2~5mol/l、絮凝劑2~10%、非離子表面活性劑0.5~10%、陰離子表面活性劑0.1~5%、ph緩沖液10~100mmol/l、醇類10~50%、離子螯合劑0.1~10mmol/l。
5、所述洗滌液1中，包含離液鹽，非離子表面活性劑、ph緩沖液以及醇類。
6、所述洗滌液2中，包含醇類、非離子表面活性劑以及ph緩沖液。
7、所述洗脫液中，包含離子螯合劑與ph緩沖液。
8、所述蛋白酶k液為濃度20mg/ml的蛋白酶k溶液。
9、所述磁珠液為濃度100mg/ml的二氧化硅包覆的磁珠。
10、所述carrier?rna中，包括poly?a?0.05~0.1mmol/l、acryl?carrier?0.1~0.15mmol/l、糖原0.03~0.12mmol/l。
11、本專利技術的carrier?rna是dna沉淀的輔助物。dna在高鹽、無水乙醇環境中溶解度很低，通過高速離心可發生沉淀，當dna濃度很低時，微量dna不足以形成沉淀，在上述環境條件下，糖原也不可溶并可與rna共沉淀，形成可視化沉淀；acryl?carrier可以明顯提高核酸沉淀的得率，更可使痕量dna的回收率達到95~98%，本身絕無核酸污染也無dna酶和rna酶活性，同時不影響酶切、連接、轉錄、pcr、轉化轉染等，也不影響核酸電泳和dna-蛋白相互作用；poly?a在提取純化過程中可幫助去除核酸離心管壁上的靜電效應，保證核酸能很好被吸附到純化柱上，減小吸附損失，提高洗脫效率，降低核酸酶攻擊待提取核酸的概率。
12、優選地，所述離液鹽為異硫氰酸胍、鹽酸胍、高氯酸鈉、高碘酸鈉、碘化鈉、氯化鈉、氯化鋰中的一種或多種。
13、優選地，所述所述非離子表面活性劑為peg?200、peg?600、np-40、triton?x-100、triton?x-114、triton?x-305、tween-20、tween-80、brij-35、brij-58、aeo-7、aeo-9、α-烯基磺酸鈉中的一種或多種。
14、優選地，所述陰離子表面活性劑為sds、sls、tls、sds、lds、sdbs中的一種或多種。
15、優選地，所述ph緩沖液為tris-hcl緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液與醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種。
16、優選地，所述醇類為乙醇、異丙醇中的一種或多種。
17、優選地，所述離子螯合劑包括edta、edta·na2、egta、8-hq中一種或多種。
18、優選地，所述絮凝劑為氯化鋁、聚合氯化鋁中的一種或多種。
19、本專利技術還提供了一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒的應用，將其用于人全血樣品的基因組提取，提取流程包括如下步驟：
20、在深孔板中，在第1/7列加入裂解結合液、蛋白酶k液、carrier?rna以及樣本；在第2/8列加入純水以及磁珠液；在第3/9列加入洗滌液1；在第4/10列加入洗滌液2；在第5/11列加入洗滌液2；在第6/12列加入洗脫液1，進行提取。
21、本專利技術的有益效果如下：
22、本專利技術的carrier?rna是dna沉淀的輔助物。dna在高鹽、無水乙醇環境中溶解度很低，通過高速離心可發生沉淀，當dna濃度很低時，微量dna不足以形成沉淀，在上述環境條件下，糖原也不可溶并可與rna共沉淀，形成可視化沉淀；acryl?carrier可以明顯提高核酸沉淀的得率，更可使痕量dna的回收率達到95~98%，本身絕無核酸污染也無dna酶和rna酶活性，同時不影響酶切、連接、轉錄、pcr、轉化轉染等，也本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述提取試劑的組分包括CaiierRNA、蛋白酶K液、磁珠液、裂解結合液、洗滌液1、洗滌液2與洗脫液。
2.根據權利要求1所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述裂解結合液包括：包含離液鹽2~5mol/L、絮凝劑2~10%、非離子表面活性劑0.5~10%、陰離子表面活性劑0.1~5%、pH緩沖液10~100mmol/L、醇類10~50%、離子螯合劑0.1~10mmol/L；
3.根據權利要求2所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述離液鹽為異硫氰酸胍、鹽酸胍、高氯酸鈉、高碘酸鈉、碘化鈉、氯化鈉、氯化鋰中的一種或多種。
4.根據權利要求2所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述非離子表面活性劑為PEG?200、PEG?600、NP-40、Triton?X-100、Triton?X-114、Triton?X-305、Tween-20、Tween-80、Brij-35、Brij-58、AEO-7、AEO-9、α-烯基磺酸鈉中的一種
5.根據權利要求2所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述陰離子表面活性劑為SDS、SLS、TLS、SDS、LDS、SDBS中的一種或多種。
6.根據權利要求2所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述pH緩沖液為Tris-HCl緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液與醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種。
7.根據權利要求2所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述醇類為乙醇、異丙醇中的一種或多種。
8.根據權利要求2所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述離子螯合劑包括EDTA、EDTA·Na2、EGTA、8-HQ中一種或多種。
9.根據權利要求2所述的一種磁珠法HBV?DNA超敏提取試劑盒，其特征在于，所述絮凝劑為氯化鋁、聚合氯化鋁中的一種或多種。
...【技術特征摘要】
1.一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒，其特征在于，所述提取試劑的組分包括caiierrna、蛋白酶k液、磁珠液、裂解結合液、洗滌液1、洗滌液2與洗脫液。
2.根據權利要求1所述的一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒，其特征在于，所述裂解結合液包括：包含離液鹽2~5mol/l、絮凝劑2~10%、非離子表面活性劑0.5~10%、陰離子表面活性劑0.1~5%、ph緩沖液10~100mmol/l、醇類10~50%、離子螯合劑0.1~10mmol/l；
3.根據權利要求2所述的一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒，其特征在于，所述離液鹽為異硫氰酸胍、鹽酸胍、高氯酸鈉、高碘酸鈉、碘化鈉、氯化鈉、氯化鋰中的一種或多種。
4.根據權利要求2所述的一種磁珠法hbv?dna超敏提取試劑盒，其特征在于，所述非離子表面活性劑為peg?200、peg?600、np-40、triton?x-100、triton?x-114、triton?x-305、tween-20...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃庚銳，譚杰峰，張佑歡，許錦濤，
申請(專利權)人：廣州奕昕生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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