【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用胰蛋白酶消化和液相色譜/質(zhì)譜工作流(lc-ms)測定人腦脊液(csf)中超磷酸化tau(特別是在tau的位置396處的絲氨酸殘基(s396)處磷酸化的tau)的方法。
技術介紹
1、追蹤阿爾茨海默病(ad)或唐氏綜合征等tau病變中tau病變進展的方法對于診斷患者或監(jiān)測他們的疾病階段具有重要意義。目前，臨床上非常需要診斷和預測生物標志物以及用于分類目的的生物標志物，以識別處于tau病變早期階段的患者，如輕度認知損害患者(mci)，這些患者后來可能發(fā)展為ad。
2、有前景的腦脊液(csf)生物標志物候選物是總tau蛋白和磷酸化tau蛋白(ptau)，它們可被證明具有足夠的診斷準確性和預測能力。本專利技術的諸位專利技術人開發(fā)了一種能夠使用在絲氨酸396處磷酸化(ps396)的tau蛋白檢測超磷酸化tau的測定法，并且已經(jīng)表明該分析/生物標志物可以顯示例如抗體治療在表達高水平人tau和tau病理學的轉基因小鼠中的作用。
3、本專利技術的諸位專利技術人發(fā)現(xiàn)了一種測量ps396-tau的可靠方法，該方法利用了當tau在絲氨酸396處磷酸化(ps396)時胰蛋白酶在氨基酸賴氨酸395后不裂解的事實，這是超磷酸化tau病理學中的標志(hall?mark)。因此，只有在此位點未磷酸化的tau蛋白才會被胰蛋白酶裂解并將產(chǎn)生肽spvvsgdtspr(seq?id?no:1)，其中s是未磷酸化的s396絲氨酸。
4、tau蛋白是一種高度復雜的結構，由(至少)6種蛋白型(proteoform)(范圍
5、在本專利技術中，目的特征肽含有絲氨酸396。胰蛋白酶的切割點是氨基酸lys(k)和arg(r)的羰基(c)側，除非其后的氨基酸被磷酸化。因此，對于ps396-tau的分析，胰蛋白酶切割產(chǎn)生特征肽tdhgaeivyk[p]spvvsgdtspr(seq?id?no:2)。然而，該肽可以(或可以不)在氨基酸t(yī)386、y394、s400、t403和s404處磷酸化。這些磷酸化的各種可能組合產(chǎn)生數(shù)百種不同的肽，每種肽都具有用于lc-ms分析的特定的色譜保留時間和/或分子量。如果使用lc-ms對含有ps396的特征肽進行直接定量分析，則需要對磷酸化肽的每個個體變異進行定量。這種方法需要大量的分析工作，更重要的是，ps396的分析信號將被“稀釋”到這些不同的肽中。由于ps396在人csf中的預期濃度在低pm范圍內(nèi)，因此如果應用這樣的直接分析，對質(zhì)譜儀靈敏度的要求可能會受到限制。
6、因此，本專利技術的一方面在于從csf獲得的樣品的胰蛋白酶消化。在本專利技術中，應用了間接分析方法，該方法允許分析集中在單個人tau衍生肽spvvsgdtspr[aa396-406](seqid?no:1)上。
7、該方法利用了s396處的磷酸化防止胰蛋白酶在該位置裂解蛋白鏈的事實，并且s396磷酸化tau蛋白的胰蛋白酶消化將因此產(chǎn)生肽tdhgaeivyk[p]spvvsgdtspr(seq?idno:2)。因此，在第一個工作流中，只有在s396處未磷酸化的tau蛋白才會被胰蛋白酶裂解并產(chǎn)生肽spvvsgdtspr(seq?id?no:1)(在用磷酸酶處理去除所有可能的磷酸化之后)。因此，spvvsgdtspr的工作流1分析對應于未磷酸化s396的量。
8、在工作流2中，應用第二次胰蛋白酶消化。肽spvvsgdtspr(seq?id?no:1)將不受該處理的影響，而tdhgaeivykspvvsgdtspr現(xiàn)在將在氨基酸賴氨酸395與絲氨酸396之間被裂解，因為該肽在絲氨酸396處不再磷酸化(通過磷酸酶處理去除)。因此，第二次胰蛋白酶消化產(chǎn)生額外量的spvvsgdtspr，并且工作流2分析對應于未磷酸化s396和磷酸化s396的總和(相當于tau的總量)。
9、因此，在工作流1和工作流2中測量的spvvsgdtspr[396-406](seq?id?no:1)的量的差異等于最初在s396處磷酸化的tau蛋白(ps396-tau)的量。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術涉及測量csf樣品中ps396?tau的方法，該方法包括以下步驟：
2、i)用胰蛋白酶處理來自患有或疑似患有tau病變的受試者的(體外)csf樣品，
3、ii)使步驟i)中的樣品經(jīng)受去磷酸化劑，隨后將部分樣品放在一邊用于步驟iv)，然后用剩余樣品進行步驟iii)，
4、iii)使來自步驟ii)的去磷酸化樣品經(jīng)受第二次胰蛋白酶處理，
5、iv)使用lc-ms測量來自步驟ii)和步驟iii)的樣品中對應于tau殘基396-406的tau肽(spvvsgdtspr(seq?id?no:1))的量。
6、該方法可用于診斷患有tau病變的患者或監(jiān)測患有tau病變的患者的疾病。可替代地，據(jù)信該方法可用于監(jiān)測患有tau病變的患者的治療效果。
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1.一種測量樣品中pS396?Tau的方法，該方法包括以下步驟i-iv，
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，該方法進一步包括比較如步驟iv)中測量的來自步驟ii)和步驟iii)的Tau肽(SPVVSGDTSPR)的量的步驟。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，該方法進一步包括將步驟iv)中獲得的結果與包含Tau殘基260-267(IGSTENLK)的對照進行比較的步驟。
4.根據(jù)權利要求1-3所述的方法，其中該受試者是人。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中該Tau病變選自阿爾茨海默病、唐氏綜合征、嗜銀顆粒病(AGD)、精神病特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者的精神病、因AD導致的情感淡漠或患有AD的患者的情感淡漠、患有路易體癡呆癥的患者的精神癥狀、進行性核上性麻痹(PSP)、額顳葉癡呆(FTD或其變體)、TBI(急性或慢性顱腦損傷)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(CBD)、皮克病、原發(fā)性年齡相關性Tau蛋白病(PART)、神經(jīng)原纖維纏結優(yōu)勢型老年性癡呆、拳擊性癡呆、慢性創(chuàng)傷性腦病、中風、中風康復、與帕金森氏病相關的神經(jīng)變性、染色體相
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中該Tau病變是阿爾茨海默病或唐氏綜合征。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法用于診斷患有Tau病變的患者的用途。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法用于監(jiān)測患有Tau病變的患者的疾病的用途。
9.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法用于監(jiān)測患有Tau病變的受試者的治療效果的用途。
10.根據(jù)權利要求9所述的用途，其中該治療是抗Tau抗體治療。
11.根據(jù)權利要求7-10中任一項所述的用途，其中該Tau病變選自阿爾茨海默病、唐氏綜合征、嗜銀顆粒病(AGD)、精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者的精神病、因AD導致的情感淡漠或患有AD的患者的情感淡漠、患有路易體癡呆癥的患者的精神癥狀、進行性核上性麻痹(PSP)、額顳葉癡呆(FTD或其變體)、TBI(急性或慢性顱腦損傷)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(CBD)、皮克病、原發(fā)性年齡相關性Tau蛋白病(PART)、神經(jīng)原纖維纏結優(yōu)勢型老年性癡呆、拳擊性癡呆、慢性創(chuàng)傷性腦病、中風、中風康復、與帕金森氏病相關的神經(jīng)變性、染色體相關的帕金森綜合征、利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-癡呆復合征)、神經(jīng)節(jié)細胞膠質(zhì)瘤和神經(jīng)節(jié)細胞瘤、腦膜血管瘤病、腦炎后帕金森綜合征、亞急性硬化性全腦炎、亨廷頓病、鉛中毒性腦病、結節(jié)性硬化癥、哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐質(zhì)沉積癥。
12.根據(jù)權利要求7-10中任一項所述的用途，其中該Tau病變是阿爾茨海默病或唐氏綜合征。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種測量樣品中ps396?tau的方法，該方法包括以下步驟i-iv，
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，該方法進一步包括比較如步驟iv)中測量的來自步驟ii)和步驟iii)的tau肽(spvvsgdtspr)的量的步驟。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，該方法進一步包括將步驟iv)中獲得的結果與包含tau殘基260-267(igstenlk)的對照進行比較的步驟。
4.根據(jù)權利要求1-3所述的方法，其中該受試者是人。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中該tau病變選自阿爾茨海默病、唐氏綜合征、嗜銀顆粒病(agd)、精神病特別是因ad導致的精神病或患有ad的患者的精神病、因ad導致的情感淡漠或患有ad的患者的情感淡漠、患有路易體癡呆癥的患者的精神癥狀、進行性核上性麻痹(psp)、額顳葉癡呆(ftd或其變體)、tbi(急性或慢性顱腦損傷)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(cbd)、皮克病、原發(fā)性年齡相關性tau蛋白病(part)、神經(jīng)原纖維纏結優(yōu)勢型老年性癡呆、拳擊性癡呆、慢性創(chuàng)傷性腦病、中風、中風康復、與帕金森氏病相關的神經(jīng)變性、染色體相關的帕金森綜合征、利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-癡呆復合征)、神經(jīng)節(jié)細胞膠質(zhì)瘤和神經(jīng)節(jié)細胞瘤、腦膜血管瘤病、腦炎后帕金森綜合征、亞急性硬化性全腦炎、亨廷頓病、鉛中毒性腦病、結節(jié)性硬化癥、哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐質(zhì)沉積癥。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：安妮瑪麗·雅各布森，萊恩·勒爾鮑克·奧爾森，尼科·范德米拉布爾，弗蘭克·沙爾克，
申請(專利權)人：H隆德貝克有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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