【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，特別涉及一種同時生產d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法。
技術介紹
1、稀有糖d-阿洛酮糖和d-塔格糖是近兩年備受矚目的兩種天然功能性低熱量甜味劑，是良好的蔗糖替代品，它們生理功能豐富，兼具口感和安全性優勢，在膳食、醫藥和保健等領域具有重要應用。研究稀有糖可以促進無糖食品的良好發展。相比天然原料提取法和化學合成法，生物轉化法具有操作簡單、成本低、環境友好等優點，是稀有糖大規模生產的首選方法，而全細胞生物轉化法相較于酶生物轉化法更加簡單、高效且穩定。
2、d-塔格糖多由l-阿拉伯糖異構酶催化d-半乳糖得到，但是d-半乳糖價格高昂，作為底物生產d-塔格糖成本高、利潤低。通過將水解乳糖為d-半乳糖和d-葡萄糖的β-半乳糖苷酶引入到d-塔格糖的生物轉化過程中，為d-塔格糖的生物合成提供直接底物d-半乳糖，是解決底物成本高這一難題的有效方法。同理，葡萄糖異構酶和d-阿洛酮糖3-差向異構酶雙酶級聯可以催化乳糖水解產物之一的d-葡萄糖直接生產d-阿洛酮糖。另外，乳清粉是乳制品生產過程中的副產品，具有很高的生化需氧量，利用不當容易造成資源浪費和環境污染。乳清粉中乳糖含量一般為70%-80%，價格低廉，以其作為底物生產具有高附加值產品d-阿洛酮糖和d-塔格糖具有重要的環保經濟價值。
3、因此，建立一種可操作性強、成本低且效率高的同時生產d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法具有重要現實意義。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術提供了一種同時生產d-阿洛酮
2、為實現上述專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案予以實現：
3、本專利技術提供了一種同時生產d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法，包括以下步驟：
4、（1）將葡萄糖異構酶基因 gi連接到載體質粒pet28a的限制性酶切位點 nde?ⅰ?和 bamhⅰ之間，構建得到重組質粒pet28a- gi；
5、（2）將d-阿洛酮糖3-差向異構酶基因 dpe連接到所述步驟（1）的重組質粒pet28a- gi的限制性酶切位點 ecorⅰ和 xhoⅰ之間，構建得到重組質粒pet28a- gi-dpe；
6、（3）將l-阿拉伯糖異構酶基因 araa連接到載體質粒pht01的限制性酶切位點 bamhⅰ和 xbaⅰ之間，構建得到重組質粒pht01- araa；
7、（4）將β-半乳糖苷酶基因 lacz連接到所述步驟（3）的重組質粒pht01- araa的限制性酶切位點 xbaⅰ和 smaⅰ之間，構建得到重組質粒pht01- araa- lacz；
8、（5）將所述步驟（2）中的重組質粒pet28a- gi-dpe以1:10的體積比加入感受態細胞 e.colibl21?(de3)中，冰浴30?min，再在42?℃水浴中熱擊45?s，立即冰浴2?min，而后加入lb液體培養基中37?℃，200?rpm復蘇1?h，再將菌液涂布于含有卡那霉素抗性的lb固體平板上，37?℃靜置培養過夜；挑取單菌落轉接至lb液體培養基中，并添加卡那霉素至濃度為100μg/ml，37?℃、200?rpm培養12?h，得到雙酶級聯工程菌株 e.coli?bl21?(de3)-pet28a- gi- dpe；
9、將所述步驟（4）中的重組質粒pht01- araa- lacz轉化到 b.?subtilis?wb800n中至終濃度為10?μg/ml，充分混勻后放入37?℃恒溫水浴中靜置45?min；然后放入37?℃、200rpm的搖床中培養3?h；接下來，將菌液涂布于含有10?μg/ml氯霉素抗性的lb固體培養基平板上，37?℃靜置培養過夜；最后，挑取單菌落轉接至lb液體培養基中，并添加氯霉素至終濃度為10?μg/ml，37?℃、200?rpm培養12?h，篩選得到雙酶級聯工程菌株 b.?subtilis?wb800n-pht01- araa- lacz；
10、（6）將所述步驟（5）中的雙酶級聯工程菌株 e.coli?bl21?(de3)-pet28a- gi-dpe接種于含有100?μg/ml卡那霉素的lb液體培養基中，37?℃、200?rpm培養至od600為0.6-0.8，然后加入誘導劑iptg至終濃度為0.025?mm，調整溫度和轉速為37?℃和180?rpm繼續誘導培養12?h；培養后的菌液14000?rpm離心5?min收集菌體。將收集的菌體用雙蒸水洗滌菌體3±1次，離心收集菌體；
11、將所述步驟（5）的雙酶級聯工程菌株 b.?subtilis?wb800n-pht01- araa- lacz按照2%的接種量接種到含有10?μg/ml氯霉素的tb培養基中37?℃、200?rpm培養至od600介于0.6至0.8，然后加入誘導劑iptg至終濃度為0.2?mm，繼續誘導培養24?h；離心收集菌液，并用雙蒸水洗滌2-3次，再次離心收集菌體；
12、用雙蒸水分別調節雙酶級聯工程菌株 e.colibl21（de3）-pet28a- gi- dpe菌濃至od600=30， b.?subtiliswb800n-pht01- araa- lacz菌濃至od600=50；分別取相同體積的兩種工程菌株菌液，離心收集菌體，用含有乳糖的底物溶液依次混合重懸兩種菌體定容至同一體積，以構建生物合成d-阿洛酮糖和d-塔格糖的反應體系，置于59-61?℃恒溫水浴鍋中反應11-本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種同時生產D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中的葡萄糖異構酶基因gi具有下列核苷酸序列之一：
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中的D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因dpe具有下列核苷酸序列之一：
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中的L-阿拉伯糖異構酶基因araA具有下列核苷酸序列之一：
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）中的β-半乳糖苷酶基因lacZ具有下列核苷酸序列之一：
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（6）的底物溶液中乳糖的濃度為140?g/L?-200?g/L，其需要使用氫氧化鈉調整pH至8.0。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述底物溶液還能夠通過乳清粉或者其他含乳糖原料經過溶解制備得到。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（6）中恒溫反應的溫度為59?℃-61?℃，反應時間為11?h-13
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（6）中雙酶級聯工程菌株的培養溫度為36℃-38?℃，培養轉速為180?rpm?-220?rpm。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-阿洛酮糖的轉化率不低于8.0%，所述D-塔格糖的轉化率不低于20%。
...【技術特征摘要】
1.一種同時生產d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中的葡萄糖異構酶基因gi具有下列核苷酸序列之一：
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中的d-阿洛酮糖3-差向異構酶基因dpe具有下列核苷酸序列之一：
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中的l-阿拉伯糖異構酶基因araa具有下列核苷酸序列之一：
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）中的β-半乳糖苷酶基因lacz具有下列核苷酸序列之一：
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（6）...
【專利技術屬性】
技術研發人員：林建強，溫鑫，林建群，宋欣，
申請(專利權)人：青島龍鼎生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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