【技術實現步驟摘要】
本公開涉及藥物與診斷，尤其涉及一種梭狀芽胞桿菌神經毒素效價檢測方法。
技術介紹
1、肉毒桿菌神經毒素(botulinum?toxins，bonts)和破傷風神經毒素(tetanustoxins，tent)是已知最強效的毒素，它們是兩種不同疾病的病原體：肉毒桿菌中毒和破傷風。二者均屬于同一毒素家族，被稱為梭狀芽孢桿菌神經毒素。這些毒素具有相同的分子結構，在細菌中產生為具有三個功能結構域的150kda原毒素。
2、bonts是由肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下產生的細胞外毒素，也是人類迄今為止發現的最致命生物毒素。人口服1μg/kg劑量的bonts即可致死，在2-36小時后可出現臨床表現，其主要特征為全身無力并最終因呼吸衰竭而死亡。由于bonts中毒劑量小，潛伏期短，致死率高，而又易于制備獲得，因此bonts需要重點監控。
3、根據抗原性可將bonts分為不同血清型。目前已確認并廣泛認可自然界可產生7種血清型的bonts，按照字母順序命名為a-g型。其中a、b、e、f型易引起人類肉毒中毒，c、d型易引起動物肉毒中毒，g型較為少見；每種血清型都因遺傳變異而存在相應的亞型。
4、無論bonts的血清型如何，其均是由二硫鍵連接的約100kda重鏈(heavy?chain，hc)和約50kda輕鏈(light?chain，lc)組成。bonts進入神經元細胞首先通過hc的c末端受體結合結構域與其表面雙受體結合，隨后在這些受體的內吞過程中被共內化，bonts的構象變化發生變化，從而允許hc的n末端異位結構域形成
5、注射用bonts能夠用于治療斜視以及其他適應癥。迄今為止，bonts已被廣泛使用，用于治療膀胱過度活動和間質性膀胱炎、頸椎肌張力障礙、偏頭疼、上肢痙攣、下肢痙攣、三叉神經痛、抑郁癥等。目前僅有兩種亞型的肉毒桿菌神經毒素即bont/a1和bont/b1被批準用做治療藥物，兩者在藥物持續作用時間和效力方面略有不同。
6、目前，注射用bonts效價檢測方法是小鼠ld50試驗法(mld50)。該方法首先將bonts稀釋為不同濃度，經由腹腔注入小鼠體內，4天內觀察小鼠半數死亡數量來確定bonts效價，該方法被認為是檢測肉毒毒素的“金標準”。小鼠bonts中毒最初的癥狀是蜂腰、后肢麻痹、呼吸困難，最后由于呼吸衰竭而死亡，引起嚴重的倫理問題。該方法需要可用于動物飼養的大型設施，并且需要訓練有素的人員。此外，mld50結果變異系數大，檢測通量低，不能滿足對大批量產品放行檢測的需求。
7、細胞學檢測方法(cell?based?assay,cba)是唯一可以全面反映bonts中毒過程中毒素與細胞結合、內化、易位、切割四個步驟的方法。cba需要將細胞與bonts孵育一定時間，然后除去bonts后裂解細胞，最終定量測定bonts生物活性。bonts活性檢測的特異性終點之一是snare切割，并且該終點可用于任何神經元細胞類型。
8、建立cba檢測方法，首先需要篩選并獲得對目標物敏感的細胞或細胞系。目前可用于cba檢測的細胞主要包括連續細胞，原代神經元或經由人誘導多能干細胞(humaninduced?pluripotent?stem?cells，hipscs)誘導分化而獲得的成熟神經元。連續細胞可以大量生產，易于培養，容易改造且相對穩定。基于這些優點，多數研究以各種連續為模型建立檢測目標物生物活性的cba。目前可獲得的連續細胞包括人神經母細胞瘤sima，sk-n-sh，sh-5y5y以及be(2)-m17細胞，大鼠嗜鉻細胞瘤pc-12細胞，小鼠腦神經瘤neuro-2a細胞等。但大多數連續細胞衍生于癌細胞有可能改變基因表達譜而導致目標待測物敏感性的改變。
9、有報道可采用大鼠背根神經節獲取原代神經元進行cba檢測。背根神經節的獲取需要麻醉并處死動物，取其脊柱，用剪刀分別剪斷兩邊連接椎體的椎弓根，去掉椎板，剝離馬尾神經，然后用眼科鑷拽出相應節段的背根神經節。上述操作容易損傷神經組織，背根神經節容易被血漬污染，尋找和分辨背根神經節困難等問題。此方法獲得神經元仍需要殺死動物，并且神經元/非神經元比例在胚胎間不同，所獲得的細胞多為混合神經元及膠質細胞，可導致活性檢測結果出現顯著差異。
10、此外，建立切割底物并檢測底物改變以反應生物學活性的終端檢測方法也非常重要。目前，最常用的蛋白質生物活性檢測方法包括蛋白免疫印跡(western?blot,wb)或酶聯免疫分析(enzyme-linked?immunosorbent?assay,elisa)，其可通過與目標物相互作用后的細胞裂解液中特定底物的裂解數量來確定目標物的生物活性。wb的檢測通量低，檢測結果需要根據拍攝的圖片并運用軟件分析比較，確定底物裂解數量，并不準確，僅僅為半定量的檢測方法，重復性差，不能全面滿足產品質量控制要求。而基于抗原抗體相互結合的雙抗夾心elisa測定法被證明是穩定且靈敏度極高，并且易于驗證。
11、有專利報道基于人神經腫瘤sima細胞并使用一種高度特異單克隆抗體，在msd(meso?scale?discovery)電化學發光(electrochemiluminescence，ecl)-elisa檢測平臺建立cba檢測方法。此方法靈敏度高，也適用于質量控制，但sima細胞未表現出運動神經元樣的特征，此外sima細胞源自癌細胞，其基因表達譜可能發生改變。有專利采用hipscs來源并分化的人神經元細胞進行固定，通過細胞膜滲透，利用堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ap)和辣根過氧化物酶(horseradish?peroxidase，hrp)在細胞內對snap25底物的總量snap25fl和切割量snap25197進行免疫學檢測，從而確定bont/a在細胞中的生物活性。此方法避免了因裂解細胞不充分而導致目標蛋白量的減少，但需要對細胞進行固定，清洗，增加細胞通透性等，檢測過程較為復雜，影響因素較多，重復性較差。
12、因此，建立高通量、準確且靈敏度高的bonts生物活性檢測方法，在產品檢本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種梭狀芽胞桿菌神經毒素效價檢測方法，其特征在于，所述檢測方法利用細胞學檢測方法進行，所述檢測方法包括：
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述梭狀芽胞桿菌神經毒素的血清型為A型。
3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述SNARE蛋白為SNAP25蛋白。
4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括：
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述標準曲線的建立方法包括：制備至少三個濃度的對照品溶液，并參照待測樣品溶液的處理方法處理后進行檢測，建立標準曲線；
6.根據權利要求4或5所述的檢測方法，其特征在于，所述間接AlphaLISA檢測的方法包括：
7.根據權利要求4-6中的任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述直接AlphaLISA檢測的方法包括：
8.根據權利要求1-7中的任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述誘導分化的前腦神經元細胞為HiPSCs誘導分化的前腦神經元細胞，包括γ-氨基丁酸神經元細胞和谷氨酸神經元細胞；
9.根
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述分化和成熟的方法包括：
...【技術特征摘要】
1.一種梭狀芽胞桿菌神經毒素效價檢測方法，其特征在于，所述檢測方法利用細胞學檢測方法進行，所述檢測方法包括：
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述梭狀芽胞桿菌神經毒素的血清型為a型。
3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述snare蛋白為snap25蛋白。
4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括：
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述標準曲線的建立方法包括：制備至少三個濃度的對照品溶液，并參照待測樣品溶液的處理方法處理后進行檢測，建立標準曲線；
6.根據權利要求4或5所述的檢測方法，其特...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊英超，楊克娜，馬霄，朱衍志，張華捷，李小娟，李婭聰，王碩，袁力勇，
申請(專利權)人：中國食品藥品檢定研究院，
類型：發明
國別省市：
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