【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)的，尤其是涉及一種引物及srap分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法和提取dna裝置。
技術(shù)介紹
1、大蒜屬于百合科蔥屬植物的地下鱗莖，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其鱗莖、花莖、嫩葉均可食用，是重要的食藥兩用植物，廣泛栽培于世界各地。我國大蒜種植歷史悠久，品種資源豐富，主要分布在山東、江蘇、河南、陜西、四川、廣西、云南等地區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均位于世界第一。
2、大蒜作為無性繁殖作物，在不同地理位置的生態(tài)環(huán)境下，通過長(zhǎng)期的定向培育和人為選擇，形成了豐富的種質(zhì)資源，因而在市場(chǎng)上有多種多樣的大蒜品種，但是不同的大蒜品種具有不同的風(fēng)味和口感，由于地域的原因，每個(gè)人之間的飲食習(xí)慣各不相同，對(duì)于各個(gè)品種的大蒜的喜愛程度也各不相同，因此，獲得一種能有效鑒別大蒜品種的方法具有重要意義。
3、近些年來，srap分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于大蒜遺傳多樣性研究中。刊名為《種子》的期刊在2021年第7期報(bào)道了一篇名為“基于srap標(biāo)記的大蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析”的文獻(xiàn)，通過采用srap分子標(biāo)記技術(shù)從而對(duì)18個(gè)大蒜群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，用popgene32軟件計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，并采用ntsys?pc21-2軟件進(jìn)行種質(zhì)間的upgma聚類分析和基于遺傳一致度的群體間聚類分析。
4、刊名為《分子植物育種》的期刊在2018年第23期報(bào)道了一篇名為“大蒜野生近緣種的srap反應(yīng)體系建立和優(yōu)化”的文獻(xiàn)，本文獻(xiàn)通過以新疆大蒜野生近緣種為材料，采用正交實(shí)驗(yàn)法，對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行4因素4水平優(yōu)化試驗(yàn)，從而便于進(jìn)一步開展大蒜野生
5、但是，迄今為止，未見報(bào)道srap分子標(biāo)記應(yīng)用于大蒜品種鑒定領(lǐng)域中。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了更加高效、準(zhǔn)確的鑒別不同品種的大蒜，本專利技術(shù)提供一種引物及srap分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法和提取dna裝置。
2、第一方面，本專利技術(shù)提供了一種引物，采用如下的技術(shù)方案：
3、一種引物共22對(duì)，所述22對(duì)引物均包括正向引物和反向引物，22對(duì)引物如下所示，且各引物的核苷酸序列如seq?id?no.1至seq?id?no.44所示：
4、
5、通過采用上述技術(shù)方案，22對(duì)引物組合具有結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，是大蒜的特異性引物。
6、可選的，所述22對(duì)srap分子標(biāo)記引物在鑒定不同的大蒜品種中的應(yīng)用。
7、通過采用上述技術(shù)方案，利用22對(duì)引物組合，可進(jìn)行特異性擴(kuò)增，進(jìn)而可得到條帶圖譜，從而可以區(qū)分、鑒別不同的大蒜品種，進(jìn)而能夠廣泛應(yīng)用于不同大蒜品種的鑒定。
8、第二方面，本專利技術(shù)提供了一種srap分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法，采用如下的技術(shù)方案：
9、一種srap分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法，包括如下步驟：
10、s1、在培養(yǎng)室穴盤內(nèi)種植多份大蒜品種，待植株長(zhǎng)到幼苗期時(shí)，摘取單株的幼嫩葉片冷凍保存；
11、s2、采用改良ctab法提取大蒜品種的基因組dna；并檢測(cè)dna的濃度和純度；
12、s3、選用10條正向引物和13條反向引物隨機(jī)組合成130對(duì)srap引物；建立一套srap-pcr分子標(biāo)記擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)；
13、s4、在多份大蒜品種中任意選擇兩個(gè)品種從而對(duì)步驟s3中的130對(duì)srap引物進(jìn)行初步篩選，初步篩選后可得出50對(duì)引物組合；通過利用篩選出的50對(duì)引物組合對(duì)大蒜品種進(jìn)行多態(tài)性條帶分析，進(jìn)而篩選出22對(duì)核心引物，篩選出的22對(duì)核心引物可區(qū)分大蒜品種；
14、s5、指紋圖譜的建立：以步驟s2中多份大蒜品種的其中一個(gè)品種所提取的dna作為模板，將22對(duì)核心引物按照步驟s3建立的srap-pcr分子標(biāo)記擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增所得到的條帶圖譜即為這個(gè)品種的指紋圖譜；從多份大蒜種質(zhì)資源中鑒別該品種時(shí)，通過使用本方法，能夠獲得所有品種的指紋圖譜，通過一一對(duì)比，與該品種的指紋圖譜相一致的，即可鑒定此大蒜為該品種。
15、所述步驟s2中采用改良ctab法提取大蒜品種的基因組dna，包括如下步驟：
16、s21、將0.3g鮮葉和1粒鋼珠放入2ml離心管中，放入液氮中冷凍，冷凍后放入組織研磨器中研磨，研磨后加入1.5ml新鮮配制的提取緩沖液[0.35m?glucose、0.1m?tris-hcl（ph8）、5mm?na-edta（ph8）、2%?pvp、1%（v/v）β-me、dd-water]，渦旋混勻，冰浴保存10min，10000rpm離心10min（4℃），棄上清；
17、s22、于沉淀中加入0.9ml?65℃預(yù)熱的裂解緩沖液[1.4m?nacl、0.1m?tris-hcl（ph8）、20mm?na-edta（ph8）、2%?ctab、2%?pvp、1%（v/v）β-me、dd-water]，渦旋混勻，65℃水浴30min；
18、s23、加入0.9ml氯仿：異戊醇（24：1）混合液，翻轉(zhuǎn)50次以上，10000rpm離心10min（15℃），將上清轉(zhuǎn)入新的2ml離心管中，加0.6體積（1ml）的預(yù)冷的異丙醇，翻轉(zhuǎn)30次，混勻，靜置10min，10000rpm，離心10min（室溫），棄上清，于沉淀中加入0.6?ml?70%的乙醇洗滌，10000rpm離心5min，倒掉上清液，通風(fēng)干燥20min；
19、s24、加0.5mlte緩沖液[10mm?tris-hcl、1mm?edta（ph8）、dd-water]溶解，65℃培養(yǎng)10—30min，加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，翻轉(zhuǎn)50次，混勻，室溫靜置5min，10000rpm離心10min；
20、s25、上清液轉(zhuǎn)入新的2ml離心管中，加0.1體積的3m醋酸鈉(ph?5.2)，加等體積的異丙醇后翻轉(zhuǎn)30次，放置30min，10000rpm離心5min，棄上清液，加0.5ml70%乙醇洗dna小團(tuán)，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，10000rpm離心5min，棄上清液，自然通風(fēng)干燥dna小團(tuán)；
21、s26、加200ulte緩沖液[10mm?tris-hcl、1mm?edta（ph8）、dd-water]溶解dna（4℃，30min以上），并保存。
22、通過采用上述技術(shù)方案，對(duì)于某一個(gè)大蒜品種，以該品種的dna作為模板，利用篩選出的22對(duì)特異性srap-pcr核心引物，經(jīng)pcr擴(kuò)增后能得到該品種的指紋圖譜，對(duì)于每一個(gè)大蒜品種都可以獲得一個(gè)特異性的指紋圖譜，進(jìn)而能夠區(qū)分和鑒別大蒜品種；由于篩選出來的22對(duì)引物組合具有結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性好的優(yōu)點(diǎn)，因此，經(jīng)過pcr擴(kuò)增后得到的指紋圖譜能夠高效、準(zhǔn)確的區(qū)分和鑒別大蒜品種，從而解決了使用常規(guī)方法鑒定大蒜品種困難、鑒別不準(zhǔn)確的問題，并且該srap分子標(biāo)記鑒定方法還具有高共顯性、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
23、可選的，所述的步驟s3中srap-pcr分子標(biāo)記擴(kuò)增采用20μlpcr反應(yīng)體系，10×b本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種引物，其特征在于：一種引物共22對(duì)，所述22對(duì)引物均包括正向引物和反向引物，22對(duì)引物如下所示，且各引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1至SEQ?ID?No.44所示：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種引物，其特征在于：所述22對(duì)SRAP分子標(biāo)記引物在鑒定不同的大蒜品種中的應(yīng)用。
3.一種SRAP分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：
4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種SRAP分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法，其特征在于：所述的步驟S3中SRAP-PCR分子標(biāo)記擴(kuò)增采用20μlPCR反應(yīng)體系，10×Buffer?2μl、Mg2+?2?mmol/L、Taq?聚合酶2?U、dNTPs?0.2?mmol?/L、模板DNA約40?ng、引物0.6?μmol?/L，無菌超純水補(bǔ)足20?ml；所述的步驟S3中PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性60S、35℃復(fù)性60S和72℃延伸60S，共5個(gè)循環(huán)，94℃變性60S、50℃復(fù)性60S和72℃延伸60S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述的步驟S3中擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)行
5.一種提取DNA裝置，其特征在于：包括提取機(jī)構(gòu)（300）、抽取機(jī)構(gòu)（400）、保溫機(jī)構(gòu)（500）、干燥機(jī)構(gòu)（600）、夾持機(jī)構(gòu)（200）、第一箱體（100）、第一箱蓋（110），所述提取機(jī)構(gòu)（300）、抽取機(jī)構(gòu)（400）、保溫機(jī)構(gòu)（500）、干燥機(jī)構(gòu)（600）依次設(shè)置在第一箱體（100）的底部，所述夾持機(jī)構(gòu)（200）設(shè)置在第一箱體（100）內(nèi)部的頂端，所述第一箱蓋（110）設(shè)置在第一箱體（100）的頂部，且第一箱蓋（110）可罩設(shè)住所述第一箱體（100）；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提取DNA裝置，其特征在于：所述夾持機(jī)構(gòu)（200）包括第一導(dǎo)軌（210）、第一移動(dòng)橫梁（220）、第二驅(qū)動(dòng)組件（270）、第二導(dǎo)軌（230）、第三驅(qū)動(dòng)組件（280）、機(jī)械臂（240）、第二伸縮氣缸（250）、機(jī)械夾手（260），所述第一導(dǎo)軌（210）設(shè)置在第一箱體（100）頂部的內(nèi)壁上，所述第一移動(dòng)橫梁（220）通過第二驅(qū)動(dòng)組件（270）的驅(qū)動(dòng)滑動(dòng)連接在第一導(dǎo)軌（210）上，所述第二導(dǎo)軌（230）設(shè)置在第一移動(dòng)橫梁（220）上，所述機(jī)械臂（240）通過第三驅(qū)動(dòng)組件（280）的驅(qū)動(dòng)滑動(dòng)連接在第二導(dǎo)軌（230）上，所述機(jī)械臂（240）通過第二伸縮氣缸（250）的驅(qū)動(dòng)可沿豎直方向滑動(dòng)連接在所述第三驅(qū)動(dòng)組件（280）上，所述機(jī)械夾手（260）設(shè)置在機(jī)械臂（240）朝向第一箱體（100）的底部的一端。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種提取DNA裝置，其特征在于：所述抽取機(jī)構(gòu)（400）包括放置室（401）、第一離心管架（402）、吸管（407）、真空泵（409）、第一管路（410）、第二移動(dòng)橫梁（412）、第三導(dǎo)軌（413）、第四驅(qū)動(dòng)組件（415）、第三伸縮氣缸（414）、第五驅(qū)動(dòng)組件（416），所述放置室（401）設(shè)置在第一箱體（100）的底部，所述第一離心管架（402）設(shè)置在所述放置室（401）的內(nèi)部，且第一離心管架（402）上開設(shè)有用于放置離心管的第三通孔（4021），所述放置室（401）的內(nèi)部開設(shè)有廢液槽（403），所述放置室（401）上活動(dòng)設(shè)置有蓋板（405），且蓋板（405）可罩設(shè)住廢液槽（403），所述放置室（401）的內(nèi)部開設(shè)有清洗槽（404），且清洗槽（404）中填充有清洗介質(zhì)，所述第二移動(dòng)橫梁（412）通過第四驅(qū)動(dòng)組件（415）的驅(qū)動(dòng)滑動(dòng)連接在第一導(dǎo)軌（210）上，所述第三導(dǎo)軌（413）設(shè)置在所述第二移動(dòng)橫梁（412）上，所述第三伸縮氣缸（414）通過第五驅(qū)動(dòng)組件（416）的驅(qū)動(dòng)滑動(dòng)連接在第三導(dǎo)軌（413）上，所述真空泵（409）設(shè)置在第一箱體（100）一側(cè)的內(nèi)壁上，所述吸管（407）設(shè)置在第三伸縮氣缸（414）上，且吸管（407）與所述真空泵（409）的進(jìn)氣口相連通，所述第一管路（410）的一端與真空泵（409）的出氣口相連通，所述第一管路（410）的另一端可與廢液槽（403）相連通。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種提取DNA裝置，其特征在于：所述保溫機(jī)構(gòu)（500）包括第三箱體（501）、第三箱蓋（502）、導(dǎo)熱板（506）、第二離心管架（507）、加熱管（508）、壓縮機(jī)（509）、溫度傳感器（510）、密封組件（511），所述第三箱體（501）設(shè)置在第一箱體（100）的底部，所述第三...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種引物，其特征在于：一種引物共22對(duì)，所述22對(duì)引物均包括正向引物和反向引物，22對(duì)引物如下所示，且各引物的核苷酸序列如seq?id?no.1至seq?id?no.44所示：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種引物，其特征在于：所述22對(duì)srap分子標(biāo)記引物在鑒定不同的大蒜品種中的應(yīng)用。
3.一種srap分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：
4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種srap分子標(biāo)記的大蒜品種鑒定方法，其特征在于：所述的步驟s3中srap-pcr分子標(biāo)記擴(kuò)增采用20μlpcr反應(yīng)體系，10×buffer?2μl、mg2+?2?mmol/l、taq?聚合酶2?u、dntps?0.2?mmol?/l、模板dna約40?ng、引物0.6?μmol?/l，無菌超純水補(bǔ)足20?ml；所述的步驟s3中pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性60s、35℃復(fù)性60s和72℃延伸60s，共5個(gè)循環(huán)，94℃變性60s、50℃復(fù)性60s和72℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；所述的步驟s3中擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)為，配置6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳槽上的每個(gè)泳道上樣量為8μl，電泳緩沖液為0.5×tbe，150?v預(yù)電泳30min，然后用200v恒壓電泳2.5?h，停止電泳并用0.1％硝酸銀染色，在觀察燈箱上拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。
5.一種提取dna裝置，其特征在于：包括提取機(jī)構(gòu)（300）、抽取機(jī)構(gòu)（400）、保溫機(jī)構(gòu)（500）、干燥機(jī)構(gòu)（600）、夾持機(jī)構(gòu)（200）、第一箱體（100）、第一箱蓋（110），所述提取機(jī)構(gòu)（300）、抽取機(jī)構(gòu)（400）、保溫機(jī)構(gòu)（500）、干燥機(jī)構(gòu)（600）依次設(shè)置在第一箱體（100）的底部，所述夾持機(jī)構(gòu)（200）設(shè)置在第一箱體（100）內(nèi)部的頂端，所述第一箱蓋（110）設(shè)置在第一箱體（100）的頂部，且第一箱蓋（110）可罩設(shè)住所述第一箱體（100）；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提取dna裝置，其特征在于：所述夾持機(jī)構(gòu)（200）包括第一導(dǎo)軌（210）、第一移動(dòng)橫梁（220）、第二驅(qū)動(dòng)組件（270）、第二導(dǎo)軌（230）、第三驅(qū)動(dòng)組件（280）、機(jī)械臂（240）、第二伸縮氣缸（250）、機(jī)械夾手（260），所述第一導(dǎo)軌（210）設(shè)置在第一箱體（100）頂部的內(nèi)壁上，所述第一移動(dòng)橫梁（220）通過第二驅(qū)動(dòng)組件（270）的驅(qū)動(dòng)滑動(dòng)連接在第一導(dǎo)軌（210）上，所述第二導(dǎo)軌（230）設(shè)置在第一移動(dòng)橫梁（220）上，所述機(jī)械臂（240）通過第三驅(qū)動(dòng)組件（280）的驅(qū)動(dòng)滑動(dòng)連接在第二導(dǎo)軌（230）上，所述機(jī)械臂（240）通過第二伸縮氣缸（250）的驅(qū)動(dòng)可沿豎直方向滑動(dòng)連接在所述第三驅(qū)動(dòng)組件（280）上，所述機(jī)械夾手（260）設(shè)置在機(jī)械臂（240）朝向第一箱體（100）的底部的一端。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種提取dna裝置，其特征在于：所述抽取機(jī)構(gòu)（400）包括放置室（401）、第一離心管架（402）、吸管（407）、真空泵（409）、第一管路（410）、第二移動(dòng)橫梁（412）、第三導(dǎo)軌（413）、第四驅(qū)動(dòng)組件（415）、第三伸縮氣缸（414）、第五驅(qū)動(dòng)組件（416），所述放置室（401）設(shè)置在第一箱體（100）的底部，所述第一離心管架（402）設(shè)置在所述放置室（401）的內(nèi)部，且第一離心管架（402）上開設(shè)有用于放置離心管的第三通孔（4021），所述放置室（401）的內(nèi)部開設(shè)有廢液槽（403），所述放置室（401）上活動(dòng)設(shè)置有蓋板（405），且蓋板（405）可罩設(shè)住廢液槽（403），所述放置室（401）的內(nèi)部開設(shè)有清洗槽（404），且清洗槽（404）中填充有清洗介質(zhì)，所述第二移動(dòng)橫梁（41...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉紅耀，張彥波，溫國昌，王振武，張清華，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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