一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝。細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后接入毒種和培養(yǎng)液，毒種使用量為每１００ｃｍ２細(xì)胞接種１ｍｌ毒種。病毒培養(yǎng)液主要包括：ＭＥＭ培養(yǎng)液９０－９５％，小牛血清３－５％，７．５％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)ｐＨ至７．２－７．６。經(jīng)澄清過(guò)濾后加入終濃度為０．３％人血白蛋白制成。本發(fā)明專利技術(shù)采用ＳＡ１４－１４－２減毒株生產(chǎn)乙腦純化疫苗，該減毒株比Ｐ３毒株生產(chǎn)的疫苗更加安全有效。本發(fā)明專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：１、用減毒株制備純化疫苗安全性好。２、用β－丙內(nèi)酯滅活病毒滅活效果好，滅活劑自然降解無(wú)殘留。３、柱層析純化性質(zhì)溫和，對(duì)病毒損傷小。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及流行性乙腦疫苗的方法，其步驟如下 選用10-14日齡、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚處死，清洗并消毒鼠 尸；無(wú)菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置 37°C 士rC培養(yǎng)3-4天。 細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后接入毒種和培養(yǎng)液，毒種使用量為每100cm2細(xì)胞接種lml毒種。 病毒培養(yǎng)液主要包括MEM培養(yǎng)液90-95X，小牛血清3-5X，7. 5%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至 7. 2-7. 6。經(jīng)澄清過(guò)濾后加入終濃度為0. 3%人血白蛋白制成。 選擇細(xì)胞生長(zhǎng)良好的細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用緩沖液沖洗去除小牛血清，緩沖液沖 洗量800-1000ml/瓶，沖洗完畢后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34t:溫室繼續(xù)培養(yǎng)。 種毒16-18小時(shí)后進(jìn)行換液，加入維持液1500-2500m1/瓶，置32-34。C溫室繼續(xù) 培養(yǎng)48-72小時(shí)。收獲前檢查細(xì)胞病變，選擇細(xì)胞瓶?jī)?nèi)細(xì)胞病變75%以上的細(xì)胞瓶進(jìn)行收 集，將細(xì)胞瓶進(jìn)行超聲，使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)收集到10-15萬(wàn)不銹鋼罐內(nèi)，搖勻即為病 毒收獲液。 病毒收獲后用14000r/min的連續(xù)流冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，流速為1500-2000m1/ min，然后用0. 5um及0. 22um的濾芯過(guò)濾。按1 : 4000的比例加入P -丙內(nèi)酯置2_8°C 7 天滅活。 將病毒收獲液濃縮60倍左右，通過(guò)凝膠柱層析，0. 02M pH7. 2的PBS洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集第一峰，即為純化后原液。用0. 22um的膜除菌過(guò)濾，然后加入0. 3-0. 5%人血白蛋白作為保護(hù)劑，加入總濃度為60ug/ml的硫柳汞防腐。病毒蛋白含量31. 1-74. 22ug/ml，按抗原含量不少于收獲液的四倍配制半成品。 各項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目經(jīng)檢測(cè)后，結(jié)果顯示均符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。 三種方法制備乙腦疫苗的工藝異同點(diǎn)如下<table>table see original document page 5</column></row><table> 以上對(duì)本專利技術(shù)的描述不具有限制性，如果本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員受其啟示，在不脫離本專利技術(shù)權(quán)利要求的保護(hù)的情況，作出本專利技術(shù)的其它結(jié)構(gòu)變形和實(shí)施方式，均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，其特征在于：步驟如下：（１）、選用１０－１４日齡、重量在１２－１５克的健康地鼠，使用乙醚處死，清洗并消毒鼠尸；無(wú)菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置３７℃±１℃培養(yǎng)３－４天；（２）、選擇細(xì)胞生長(zhǎng)良好的細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用緩沖液沖洗去除小牛血清，緩沖液沖洗量８００－１０００ｍｌ／瓶，沖洗完畢后每瓶加入１０００ｍｌ病毒感染液，立即置３２－３４℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)；（３）、種毒１６－１８小時(shí)后進(jìn)行換液，加入維持液１５００－２５００ｍｌ／瓶，置３２－３４℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)４８－７２小時(shí)；收獲前檢查細(xì)胞病變，選擇細(xì)胞瓶?jī)?nèi)細(xì)胞病變７５％以上的細(xì)胞瓶進(jìn)行收集，將細(xì)胞瓶進(jìn)行超聲，使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)收集到１０－１５萬(wàn)不銹鋼罐內(nèi)，搖勻即為病毒收獲液；（４）、病毒收獲后用１４０００ｒ／ｍｉｎ的連續(xù)流冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，流速為１５００－２０００ｍｌ／ｍｉｎ，然后用０．５ｕｍ及０．２２ｕｍ的濾芯過(guò)濾，按１∶４０００的重量比例加入β－丙內(nèi)酯置２－８℃７天滅活；（５）、將病毒收獲液濃縮６０倍左右，通過(guò)凝膠柱層析，０．０２ＭｐＨ７．２的ＰＢＳ洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為２８０ｎｍ，收集第一峰，即為純化后原液；用０．２２ｕｍ的膜除菌過(guò)濾，然后加入０．３－０．５％人血白蛋白作為保護(hù)劑，加入總濃度為６０ｕｇ／ｍｌ的硫柳汞防腐，病毒蛋白含量３１．１－７４．２２ｕｇ／ｍｌ，按抗原含量不少于收獲液的四倍配制半成品。...

【技術(shù)特征摘要】
一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下(1)、選用10-14日齡、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚處死，清洗并消毒鼠尸；無(wú)菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置37℃±1℃培養(yǎng)3-4天；(2)、選擇細(xì)胞生長(zhǎng)良好的細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用緩沖液沖洗去除小牛血清，緩沖液沖洗量800-1000ml/瓶，沖洗完畢后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)；(3)、種毒16-18小時(shí)后進(jìn)行換液，加入維持液1500-2500ml/瓶，置32-34℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)；收獲前檢查細(xì)胞病變，選擇細(xì)胞瓶?jī)?nèi)細(xì)胞病變75％以上的細(xì)胞瓶進(jìn)行收集，將細(xì)胞瓶進(jìn)行超聲，使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)收集到10-15萬(wàn)不銹鋼罐內(nèi)，搖勻即為病毒收獲液；(4)、病毒收獲后用14000r/...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姚偉，蘇波，沈吉友，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：86[中國(guó)|杭州]