【技術實現步驟摘要】
本專利技術專利涉及一種突變型t4?dna連接酶、其編碼dna、試劑盒及其在文庫構建中的應用，屬于生物。
技術介紹
1、隨著生命科學的發展，我們需要分析多物種的遺傳信息，ngs又稱高通量測序，可以一次性讀取幾十萬到幾百萬條dna分子的序列，能提供豐富的遺傳學信息。而ngs的首要步驟是文庫制備，文庫制備對于ngs工作流程至關重要。該步驟會制備出兼容測序儀的dna或rna樣本。一般的文庫構建通常會先將dna進行片段化，然后將片段化后的dna末端補平，再在補平后的dna片段的3’端加a，5’端進行磷酸化，最后向dna片段兩端添加特定的接頭來構建測序文庫。
2、接頭和dna片段最初通過a/t堿基互補完成配對，然后在連接酶的催化作用下，dna片段和接頭的5’-磷酸末端和3’-羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，達到穩定的連接。因此穩定高效的連接酶，對ngs測序顯得尤為重要。
3、t4?dna連接酶（t4?dna?ligase）是由t4噬菌體30基因編碼的一類雙鏈dna連接酶，可以催化相鄰dna鏈的5’-磷酸末端和3’-羥基末端形成磷酸二酯鍵的反應，利用這一特性，t4?dna連接酶廣泛被用于基因工程的各個領域，包括基因克隆、高通量測序和高通量篩選等。
4、由于t4?dna連接酶的反應底物通常是經過酶切處理的，所以難免會在連接反應中殘留上一步反應的離子，但通常，野生型（wt）t4?dna連接酶的反應條件溫和，對熱敏感，穩定性低，容易失活。高鹽、高溫都會使其酶活受到抑制甚至會造成不可逆的失活。因此，一款高效高穩定性的t
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種用于文庫構建的高效的突變型t4?dna連接酶，具有更高的連接效率。
2、本專利技術采用的技術方案為：一種突變型t4?dna連接酶，在野生型t4?dna?連接酶的基礎上，至少具有下述的六個氨基酸位點突變：s14d（第14位的絲氨酸突變為天冬氨酸）、q19i（第19位的谷氨酰胺突變為異亮氨酸）、s40y（第40位的絲氨酸突變為酪氨酸）、v108f（第108位的纈氨酸突變為苯丙氨酸）、q133m（第133位的谷氨酰胺突變為甲硫氨酸）、n357p（第357位的天冬酰胺突變為脯氨酸），以及下述三個突變位點中0~3個突變位點：a85p（第85位的丙氨酸突變為脯氨酸）、v169i（第169位的纈氨酸突變為異亮氨酸）、d480m（第480位的天冬氨酸突變為甲硫氨酸）；其中野生型t4?dna連接酶的氨基酸序列如seq?id?no.10所示。所述突變型t4?dna連接酶的氨基酸序列如seq?id?no.1-8中任一項所示。
3、其中效果最佳的突變型t4?dna連接酶為：在野生型t4?dna連接酶基礎上，具有下述的氨基酸位點突變：s14d、q19i、s40y、a85p、v108f、q133m、v169i、n357p、d480m，其氨基酸序列如seq?id?no：8所示，其編碼dna序列如seq?id?no：9所示。
4、該突變型t4?dna連接酶的反應溫度為15℃~45℃，突變型t4?dna連接酶的反應buffer中的離子濃度為50~350mm。
5、本專利技術還公開了上述的突變型t4?dna連接酶在連接dna片段中的應用，以及文庫構建中的應用。
6、本專利技術還公開了一種dna連接試劑盒，包含上述的突變型t4?dna連接酶。
7、本專利技術還公開了一種核酸建庫試劑盒，包含上述的突變型t4?dna連接酶。
8、本專利技術還公開了一種快速dna建庫試劑盒，試劑盒包括：
9、片段化末修加a試劑；
10、接頭連接試劑，其中接頭連接試劑包括前述的突變型t4?dna連接酶；
11、文庫擴增試劑。
12、優選的，所述片段化末修加a試劑包含多種酶及其反應buffer的混合物，其中的酶包含片段化酶、末端修復酶、磷酸激酶及dna聚合酶。
13、優選的，所述片段化末修加a試劑的反應溫度為30℃~40℃，反應時間為3~30min。
14、優選的，所述片段化末修加a試劑包括nacl、mgcl2，每種濃度為50~350mm。
15、優選的，所述片段化末修加a試劑中mgcl2濃度300mm，nacl濃度200mm。
16、優選的，所述接頭連接試劑為突變型t4?dna連接酶與其反應buffer的混合物。
17、優選的，接頭連接試劑中鹽離子濃度為50~350mm。
18、優選的，接頭連接試劑的反應溫度為15℃~45℃。
19、優選的，突變型t4?dna連接酶的使用量為1000u~5000u。
20、優選的，所述文庫擴增試劑為高保真dna聚合酶與其反應buffer的混合物。
21、本專利技術的快速的穩定的核酸建庫試劑盒中的片段化試劑、文庫擴增試劑，可以采用翌圣生物的hieff?ngs??onepot?pro?dna?library?prep?kit?v2（cat.12195）一步法dna建庫試劑盒組分。
22、本專利技術的突變型t4?dna連接酶具有更高的連接效率，用于建庫時，可以提高文庫產量。其中的突變型t4?dna連接酶8更是具有耐鹽和熱穩定的特性，對鹽濃度敏感性低，可無需純化，直接承接多種酶切或者末端修復反應。本專利技術的突變型t4?dna連接酶8對溫度敏感性低，可在室溫存放4周，活性無明顯下降，使其反應和儲存條件更加寬松，更加穩定。本專利技術的快速的穩定的核酸建庫試劑盒，只有三種組分，使用更方便，自動化儀器適配性高，2.5h可以實現任意（0.1ng~2ug）投入量建庫，滿足多種高通量測序建庫的需求。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種突變型T4?DNA連接酶，其特征為：在野生型T4?DNA?連接酶的基礎上，至少具有下述的六個氨基酸位點突變：S14D、Q19I、S40Y、V108F、Q133M、N357P，還包括A85P、V169I、D480M中的0~3個突變位點，其中野生型T4?DNA連接酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.10所示。
2.根據權利要求1所述的突變型T4?DNA連接酶，其特征為：所述突變型T4?DNA連接酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1~8中任一項所示。
3.根據權利要求1或2所述的突變型T4?DNA連接酶，其特征在于所述突變型T4?DNA連接酶的反應溫度為15℃~45℃，所述突變型T4?DNA連接酶的反應Buffer中的離子濃度為50~350mM。
4.權利要求1-3中任一項所述的突變型T4?DNA連接酶的編碼DNA。
5.根據權利要求4所述的編碼DNA，其特征在于其序列如SEQ?ID?No.9所示。
6.權利要求1-3中任一項所述的突變型T4?DNA連接酶在連接DNA片段中的應用。
7.權利要求1-3中任
8.一種DNA連接試劑盒，其特征在于包括權利要求1-3中任一項所述的突變型T4?DNA連接酶。
9.一種核酸建庫試劑盒，其特征在于包括權利要求1-3中任一項所述的突變型T4?DNA連接酶。
10.一種快速DNA建庫試劑盒，其特征在于試劑盒包括：
11.根據權利要求10所述的快速DNA建庫試劑盒，其特征在于所述片段化末修加A試劑包含多種酶及其反應buffer的混合物，其中的酶包含片段化酶、末端修復酶、磷酸激酶及DNA聚合酶。
12.根據權利要求10所述的快速DNA建庫試劑盒，其特征在于所述接頭連接試劑為突變型T4?DNA連接酶與其反應buffer的混合物。
13.根據權利要求10所述的快速DNA建庫試劑盒，其特征在于所述文庫擴增試劑為高保真DNA聚合酶與其反應buffer的混合物。
...【技術特征摘要】
1.一種突變型t4?dna連接酶，其特征為：在野生型t4?dna?連接酶的基礎上，至少具有下述的六個氨基酸位點突變：s14d、q19i、s40y、v108f、q133m、n357p，還包括a85p、v169i、d480m中的0~3個突變位點，其中野生型t4?dna連接酶的氨基酸序列如seq?id?no.10所示。
2.根據權利要求1所述的突變型t4?dna連接酶，其特征為：所述突變型t4?dna連接酶的氨基酸序列如seq?id?no.1~8中任一項所示。
3.根據權利要求1或2所述的突變型t4?dna連接酶，其特征在于所述突變型t4?dna連接酶的反應溫度為15℃~45℃，所述突變型t4?dna連接酶的反應buffer中的離子濃度為50~350mm。
4.權利要求1-3中任一項所述的突變型t4?dna連接酶的編碼dna。
5.根據權利要求4所述的編碼dna，其特征在于其序列如seq?id?no.9所示。
6.權利要求1-3中任一項所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹振，楊春玲，劉娜，李麥麥，
申請(專利權)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。