本發明專利技術提供了一種用酶比色反應測定β－羥丁酸的方法及其配用的試劑盒和其用途。在Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ緩沖液體系下血清β－羥丁酸與輔酶Ｉ在β－羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶Ｉ，生成的還原型輔酶Ｉ和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在５０５ｎｍ處的紅色物質甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ），據此可在５０５ｎｍ波長處測定紅色產物吸光度的變化來定量生物樣本中β－羥丁酸的含量。本法可線性測定生物樣本中β－羥丁酸濃度范圍（０～４．５ｍｍｏｌ／Ｌ），該測定用于判斷人體酮癥酸中毒診斷，本發明專利技術所用試劑應用液體雙試劑，測定β－羥丁酸所需樣本量少，此外，測定時反應時間短，操作簡單，適用于大量檢測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫學檢驗測定
，具體涉及一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法及其配用的試劑盒和其用途。
技術介紹
目前血清|3 -羥丁酸的測定目前檢測的方法是酶動力學法，在輔酶I (NAD+)存在的條件下，P-羥丁酸在P-羥丁酸脫氫酶的作用下生成乙酰乙酸、還原型輔酶I(NADH)及氫離子，反應生成的還原型輔酶I (NADH)在340nm吸光度的變化可以間接反映病人血清中的P-羥丁酸的濃度。其反應過程如下 e -羥丁酸脫氫酶e -羥丁酸+輔酶i--^乙酰乙酸+還原型輔酶i +氫離子 但是此方法易受外源性的干擾。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，而提供一種在酶動力學法反 應測定P-羥丁酸的基礎上偶聯了一步酶反應，從而保證精確度高及其配速度快、操作簡 單的用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法。 本專利技術的另一個目的是提供用以實現用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用 的試劑盒。 本專利技術的第三個目的是一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒 的用途，用來判斷人體酮癥酸中毒程度。 本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案為一種用酶比色反應測定P-羥丁 酸的方法，所采取的措施為P-羥丁酸與輔酶I在P-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙 酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生 成最高吸光率在505nm處的紅色物質甲月替(formazane)，并在505nm波長處測定紅色物質 甲月替(formazane)吸光度的變化來定量生物樣本中P _羥丁酸的含量，其反應方程式如下 0 -羥丁酸脫氫酶e-羥丁酸+輔酶i---------^乙酰乙酸+還原型輔酶i+氫離子黃遞酶還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶I。 采取的措施還包括 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法中，上述的反應過程具體為在0. 225ml的試劑I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置于37。C水浴5分鐘，并 讀取吸光度AO，加入0. 075ml的試劑11，37水浴5分鐘后，讀取吸光度Al， AA = Al-AO。 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法中，所述的試劑I包括 lOOmmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/ L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括1KU/L的P -羥丁酸脫氫 酶。 在上述的一種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法中，其特征是13 -羥丁酸的含 量計算按以下公式進行計算 P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ; 其中AX =樣本吸光率A5。5 Ac =標準品吸光率A5。5Ec = P -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)。 —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成 分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及266測試/ 盒，所述的試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml ，試劑II為40ml 。 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒中，所述的每個 試劑盒包含試劑I 一瓶60ml 、試劑II 一瓶20ml 、 P -羥丁酸標準品一瓶1ml 、 P -羥丁酸異 常血清對照一瓶1ml 。 —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，該測定用于判斷 人體酮癥酸中毒診斷。 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途中，所依據的原理反應方程式如下 0 -羥丁酸脫氫酶e-羥丁酸+輔酶I---------^乙酰乙酸+還原型輔酶I +氫離子黃遞酶還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶1。 與現有技術相比，本專利技術的優點在于可線性測定生物樣本中P-羥丁酸濃度范 圍，并應用液體雙試齊U，測定P _羥丁酸所需樣本量少，僅需6 P L血清即可，此夕卜，測定時反 應時間短，操作簡單，適用于大量檢測，同時也方便通過測定血中P-羥丁酸的含量可作為 糖尿病患者病情變化的指標，為防止并發癥的產生和酮癥酸中毒形成提供了及時可靠的防 治依據。具體實施例方式以下是本專利技術的具體實施例，對本專利技術的技術方案作進一步的描述，但本專利技術并 不限于這些實施例。 本專利技術酶比色法反應測定13 -羥丁酸是在酶動力學法反應測定13 -羥丁酸的基礎上偶聯了一步酶反應，反應過程當中，首先P-羥丁酸在P-羥丁酸脫氫酶的作用下生成乙 酰乙酸、還原型輔酶I及氫離子，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下 反應生成紅色物質甲月替(formazane)在505nm處有最高吸光度，其反應方程式如下 e -羥丁酸脫氫酶e-羥丁酸+輔酶i---------^乙酰乙酸+還原型輔酶i+氫離子黃遞酶還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶I 1.試劑組成試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶 2. P -羥丁酸測定 1)反應過程在0. 225ml的試劑I {100,1/LTris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20,1/L的草 酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫}中加入L的 0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置于37。C水浴5分鐘，并讀取吸光度A0，加入0. 075ml的 試劑II (1KU/LP -羥丁酸脫氫酶)，37t:水浴5分鐘后，讀取吸光度Al， AA = Al-AO。 2)計算及結果 |3 -羥丁酸的含量計算按以下公式進行計算 P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX A Ax/ A Ac ; 其中AX =樣本吸光率A5。5 Ac =標準品吸光率A5。5 Ec = |3 -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)， 結果13 -羥丁酸線性范圍0 4. 5mmol/L。 —種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成 分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及266測試/ 盒，所述的試劑I包括lOOmmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml，試劑II為40ml，所述的每個試劑盒包 含試劑I 一瓶60ml、試劑II 一瓶20ml、 P -羥丁酸標準品一瓶lml、 P -羥丁酸異常血清對 照一瓶lml，檢測介質血清，主要本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用酶比色反應測定β－羥丁酸的方法，其特征是：β－羥丁酸與輔酶Ｉ在β－羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶Ｉ，生成的還原型輔酶Ｉ和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在５０５ｎｍ處的紅色物質甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ），并在５０５ｎｍ波長處測定紅色物質甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ）吸光度的變化來定量生物樣本中β－羥丁酸的含量，其反應方程式如下：β－羥丁酸＋輔酶Ｉ＊→乙酰乙酸＋還原型輔酶Ｉ＋氫離子還原型輔酶Ｉ＋碘硝基四氮唑紫＊→甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ）＋輔酶Ｉ。
【技術特征摘要】
一種用酶比色反應測定β-羥丁酸的方法，其特征是β-羥丁酸與輔酶I在β-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在505nm處的紅色物質甲月替(formazane)，并在505nm波長處測定紅色物質甲月替(formazane)吸光度的變化來定量生物樣本中β-羥丁酸的含量，其反應方程式如下F2009101556381C00011.tif2. 根據權利要求l所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是上述的反應過程具體為在0. 225ml的試劑I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置 于37t:水浴5分鐘，并讀取吸光度AO，加入0. 075ml的試劑11，37t:水浴5分鐘后，讀取吸 光度Al， AA = Al-AO。3. 根據權利要求2所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是所述 的試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmo1/ L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括1KU/L的 P-羥丁酸脫氫酶。4. 根據權利要求3所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是P-羥 丁酸的含量計算按以下公式進行計算P -羥丁酸濃度(mmol/...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張聞，
申請(專利權)人：張聞，
類型：發明
國別省市：97[中國|寧波]
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