一種定標測定５’－核苷酸酶活性的方法及其配用的試劑盒和其用途技術

本發明專利技術提供了一種定標測定５’－核苷酸酶的方法及其配用的試劑盒和其用途，本發明專利技術用５’－核苷酸酶脫脫氫酶法檢測試劑盒確定５’－核苷酸酶標準品的活性，再應用Ｔｒｉｎｄｅｒ氏法以標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中５’－核苷酸酶的活性。本發明專利技術優點在于解決了Ｔｒｉｎｄｅｒ氏法的缺陷，提高了精確度，減少了儀器誤差以及增強了５’－核苷酸酶正常參考范圍數據的可比性且通過測定５’－核苷酸酶的活性用于原發性和轉移性肝癌、膽道癌、胰腺癌、膽道阻塞、膽管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、藥物性肝損傷等疾病的診斷等，適合在醫院中進行推廣使用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫學檢驗測定
，具體涉及一種定標測定5'-核苷酸酶的方法及其配用的試劑盒和其用途。
技術介紹
現有技術中用Trinder氏法定量測定5'-核苷酸酶活性在臨床化學檢驗上較為普遍，但是，Trinder氏法缺點在于沒能使用一種公認的標準法測定的5'-核苷酸酶標準品，從而造成測試精確度下降、不同實驗室應用不同生化分析儀引起的儀器誤差，此外還是5'-核苷酸酶正常參考范圍數據混亂、不可比擬性的主要原因。 5'-核苷酸酶脫氫酶法應用5'-核苷酸酶解5'-次黃嘌呤核苷酸生成次黃嘌呤核苷和氨，氨和a -酮戊二酸以及還原性輔酶在谷氨酸脫脫氫酶的作用下反應生成谷氨酸及輔酶，在340nm處檢測NADH的消耗速率來測定5'-核苷酸酶活性通過制定氨標準曲線，可定量5'-核苷酸酶活性，5'-核苷酸酶活性定義為在5'-核苷酸酶脫氫酶法條件下37°C每分鐘產生一個P mol氨所需5'-核苷酸酶的量，其原理反應方程式如下5'-核苷酸酶5'-次黃嘌呤核苷酸+水--^次黃嘌呤核苷+氨谷氨酸脫氫酶氨+ a —酮戊二酸+還原性輔酶I 二鈉鹽--^谷氨酸+輔酶 但是5' _核苷酸酶脫氫酶法可定量測定5' _核苷酸酶活性，但此法易受外源性氨的干擾，不適于臨床生化檢驗。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，而提供一種在Trinder氏法中加入5'-核苷酸酶標準品，用5'-核苷酸酶脫氫酶法確定5'-核苷酸酶標準品的活性，再應用Trinder氏法以5'-核苷酸酶標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中5'-核苷酸酶活性，從而保證精確度高，測定速度快，且減少了儀器誤差以及增強了 5'-核苷酸酶正常參考范圍數據的可比性的定標測定5'-核苷酸酶活性的方法。 本專利技術的另一個目的是提供用以實現定標測定5'-核苷酸酶活性的方法的配用的試劑盒。 本專利技術的第三個目的是一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法配用的試劑盒的用途，主要是用于提供5'-核苷酸酶的活性測定用于急性肝損傷及殘留病變的診斷以及協助慢性肝病及肝纖維化的診斷。 本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案為一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是包括以下步驟 步驟一是確定5' _核苷酸酶標準品的活性； 步驟二是再通過5' _核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黃嘌呤氧化酶及過氧化物酶酶 解生成醌化合物； 步驟三是以連續監測醌化合物在546nm處吸光度的上升速率結合標準品的活性 為參照，定量測定生物樣本中5'-核苷酸酶的活性。 采取的措施還包括 在上述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的步驟一中具體操作為 將5'-核苷酸酶樣本與試劑RI同時加入，并孵育180秒，然后加入試劑RII，在340nm處連 續120秒定量測定吸光度，并用不同濃度氨代替底物5'-次黃嘌呤核苷酸，按上述方法在 340nm處用測試儀定量測定吸光度，以此畫出標準曲線，有5'-核苷酸酶標準品的吸光度從 標準曲線上求出對應的氨濃度，并將其除以反應時間既得出5'-核苷酸酶標準品活性。 在上述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的試劑RI包括lOmol/ L的5'-次黃嘌呤核苷酸、0. 015mol/L的a_酮戊二酸、0. 30X 10—3mol/L的還原型輔酶I 二 鈉鹽以及0. 10mol/L的且pH值為7. 20的磷酸緩沖液，所述的試劑RII為200U/ml的谷氨 酸脫脫氫酶。 在上述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的5'-核苷酸酶樣本為 8iiL，試齊U I為150iiL，試劑II為75iiL，5' _核苷酸酶樣本與試劑I同時加入，在第180 秒加入試劑II，且溫度反應溫度控制37°C。 在上述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的波長的主波長為 560nmnm，副波長為700nm。 在上述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的步驟三中的計算按以 下公式進行計算 測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(A A/min)，(△Ayrain + AA2/min +...............AAt/min)△ A/min =-t A A/min代表測試時間第lmin吸光度變化率 A A2/min代表測試時間第2min吸光度變化 ............................................. A At/min代表測試時間第tmin吸光度變化率 t為測試時間 樣本5'-核苷酸酶活性=(A Ax/ A Ac) X Ec 其中AAX =樣本A A/min AAC =標準品AA/min Ec = 5'-核苷酸酶標準品的活性。 —種定標測定5' _核苷酸酶活性的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成分 組成包括試劑Rl、試劑R2、5'-核苷酸酶標準品、5'-核苷酸酶質控血清以及533測試/ 盒，所述的試劑Rl包括80mol/L的甘氨酸緩沖液、2mol/L的N-乙基_N_ (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽、0. 5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0. 8KU/L的黃嘌呤氧化酶以及0. 6KU/L的過氧化物酶，所述的試劑R2包括1Omol/L的5'-次黃嘌呤核苷酸以及2mol/L的4-氨基安替比林，所述的5'-核苷酸酶標準品為人源基因重組蛋白，5'-核苷酸酶異常血清為人源基因重組蛋白和人血清。 在上述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法及其配用的試劑盒中，所述的試劑盒包含試劑R1為80ml/l瓶X2，試劑R2為80ml/l瓶，5'-核苷酸酶標準品lml/1瓶，5' _核苷酸酶異常血清2ml/1瓶。 —種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法及其配用的試劑盒的用途中，該測定用于原發性和轉移性肝癌、膽道癌、胰腺癌、膽道阻塞、膽管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、藥物性肝損傷等疾病的診斷。 在上述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法及其配用的試劑盒的用途中，所依據的原理反應方程式如下5'-核苷酸酶5' -次黃嘌呤核苷酸+水--^次黃嘌呤核苷+氨嘌呤核苷磷酸化酶次黃嘌呤核苷+磷酸鹽--^次黃嘌呤+核糖-1-磷酸黃嘌呤氧化酶次黃嘌呤+水+氧氣--^過氧化氫+尿酸過氧化物酶過氧化氫+4-氨基安替比林+N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽--^醌化合物+水。 與現有技術相比，本專利技術的優點在于用5' _核苷酸酶脫氫酶法確定5' _核苷酸酶標準品的活性，再應用Trinder氏法以5'-核苷酸酶標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中5'-核苷酸酶活性，本專利技術解決了 Trinder氏法的缺陷，提高了測試精確度、減少了儀器誤差和增強了 5'-核苷酸酶正常參考范圍數據的可比性，也方便了通過測定5'-核苷酸酶的活性用于判斷該測定用于原發性和轉移性肝癌、膽道癌、胰腺癌、膽道阻塞、膽管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、藥物性肝損傷等疾病的診斷，適合在醫院中進行推廣使用。具體實施例方式以下是本專利技術的具體實施例，對本專利技術的技術方案作進一步的描述，但本專利技術并不限于這些實施例。 1、5'-核苷酸酶標準品和其活性的確定 (1) 5'-核苷酸酶標準品活性0-100U/L人源基因重組5'-核苷酸酶 (2) 5' _核苷酸酶標準品活性的確定 試劑組成 試劑RI :包括10mol/L的5'本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種定標測定５’－核苷酸酶活性的方法，其特征是：包括以下步驟：　　步驟一是確定５’－核苷酸酶標準品的活性；　　步驟二是再通過５’－核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黃嘌呤氧化酶及過氧化物酶酶解生成醌化合物；　　步驟三是以連續監測醌化合物在５４６ｎｍ處吸光度的上升速率結合標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中５’－核苷酸酶的活性。

【技術特征摘要】
一種定標測定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是包括以下步驟步驟一是確定5’-核苷酸酶標準品的活性；步驟二是再通過5’-核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黃嘌呤氧化酶及過氧化物酶酶解生成醌化合物；步驟三是以連續監測醌化合物在546nm處吸光度的上升速率結合標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中5’-核苷酸酶的活性。2. 根據權利要求1所述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 步驟一中具體操作為將5'-核苷酸酶樣本與試劑RI同時加入，并孵育180秒，然后加入試 劑RII，在340nm處連續120秒定量測定吸光度，并用不同濃度氨代替底物5'-次黃嘌呤核 苷酸，按上述方法在340nm處用測試儀定量測定吸光度，以此畫出標準曲線，有5'-核苷酸 酶標準品的吸光度從標準曲線上求出對應的氨濃度，并將其除以反應時間既得出5'-核苷 酸酶標準品活性。3. 根據權利要求2所述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 試劑RI包括10mol/L的5'-次黃嘌呤核苷酸、0. 015mol/L的a-酮戊二酸、0. 30X 10—3mol/ L的還原型輔酶I 二鈉鹽以及0. 10mol/L的且pH值為7. 20的磷酸緩沖液，所述的試劑RII 為200U/ml的谷氨酸脫脫氫酶。4. 根據權利要求3所述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 5'-核苷酸酶樣本為8iiL，試劑I為150iiL，試劑II為75iiL，5'-核苷酸酶樣本與試劑I 同時加入，在第180秒加入試劑II，且溫度反應溫度控制37°C。5. 根據權利要求4所述的定標測定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的波長 的主波長為560nm nm，副波長為700nm。6. 根據權利要求5所述的一種定標測定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 步驟三中的計算按以下公式進行計算測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(AA/min)，<formula>for...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張聞，
申請(專利權)人：張聞，
類型：發明
國別省市：97[中國|寧波]