【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥，具體涉及一種有效抑制補(bǔ)體c3因子基因表達(dá)的sirna。
技術(shù)介紹
1、補(bǔ)體系統(tǒng)是一組存在于人或脊椎動物血清及體液中的可溶性蛋白及一組存在于血細(xì)胞與其他組織細(xì)胞表面的膜結(jié)合蛋白和補(bǔ)體受體。生理?xiàng)l件下，絕大多數(shù)補(bǔ)體固有成分均以酶原或非活化形式存在，只有被某些物質(zhì)激活后，補(bǔ)體各固有成分才能被觸發(fā)，按一定順序發(fā)生酶促級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生多種具有生物學(xué)活性的物質(zhì)，輔助對抗感染的防御機(jī)制和介導(dǎo)多種炎癥過程，引起組織損傷、炎癥反應(yīng)和過敏反應(yīng)等許多免疫生物學(xué)效應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)對于維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡具有重要作用，是機(jī)體先天免疫的重要組成成分。當(dāng)補(bǔ)體過度激活時，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并影響凝血和纖維蛋白溶血系統(tǒng)，從而引起病理性損傷。
2、補(bǔ)體活化途徑大致可分為三種，經(jīng)典途徑(第一途徑)、旁路途徑(第二途徑)和凝集素途徑。三種活化途徑都需經(jīng)由c3參與才能最終形成膜攻擊復(fù)合物并發(fā)揮作用，因此c3的激活在補(bǔ)體系統(tǒng)中是最關(guān)鍵的一環(huán)。
3、c3是血液中含量最多的補(bǔ)體成分。正常情況下，c3可自然緩慢地裂解，產(chǎn)生的少量c3b可迅速被i因子滅活；而當(dāng)c3被激活時，其裂解產(chǎn)物c3b又可在b因子和d因子的參與作用下合成新的c3bbb，后者進(jìn)一步使c3裂解，這種正反饋效應(yīng)使得激活顯著放大，嚴(yán)重時形成炎癥因子風(fēng)暴。
4、通常，補(bǔ)體c3升高見于某些急性炎癥或者傳染病早期。近些年，研究發(fā)現(xiàn)c3水平在老年性視網(wǎng)膜黃斑變性(amd)和一些腫瘤發(fā)生時也有升高，與發(fā)病率有顯著關(guān)聯(lián)。
5、1、補(bǔ)體因子c3與老年性黃斑變
6、老年性黃斑變性是一種進(jìn)展性視網(wǎng)膜失調(diào)性疾病，其特征性表現(xiàn)為玻璃膜疣形成、黃斑區(qū)色素改變、地圖狀萎縮以及脈絡(luò)膜新生血管形成并伴有滲出，全世界范圍內(nèi)有超過3300萬患者。在老年性黃斑變性患者的脈絡(luò)膜組織中，有炎性細(xì)胞浸潤，玻璃體疣中出現(xiàn)了各種免疫活性物質(zhì)，補(bǔ)體活化分子明顯升高。在發(fā)生老年性黃斑變性的視網(wǎng)膜色素上皮亞結(jié)構(gòu)、玻璃體疣和脈絡(luò)膜中，出現(xiàn)了補(bǔ)體因子c3的裂解成分。研究顯示，c3a可加速血管內(nèi)皮生長因子處理的新生血管性老年性黃斑變性模型的形成；當(dāng)采用遺傳技術(shù)抑制c3a的受體表達(dá)時，降低了激光損傷后的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)、淋巴細(xì)胞招募和新生血管生成；利用抗體中和c3a或者用藥物阻斷其受體，也可減少新生血管的生成。因此補(bǔ)體因子c3是一個可能合理的候選靶標(biāo)。
7、進(jìn)一步研究顯示，補(bǔ)體因子c3基因的變異與老年性黃斑變性顯著相關(guān)，提示在老年性黃斑變性病因?qū)W上補(bǔ)體途徑可能發(fā)揮了重要的作用。如已鑒定出的lys155gln、lys65gln、arg735trp、ser1619arg、arg80gly等變異，可能導(dǎo)致遺傳力缺失，引起個體對老年性黃斑變性易感性增加。
8、盡管補(bǔ)體因子c3基因型在arg102gly和leu314pro之間存在強(qiáng)烈的連鎖不平衡，使得很難區(qū)分其對疾病發(fā)生是否都發(fā)揮了作用，但數(shù)據(jù)顯示arg102gly多態(tài)性在老年性黃斑變性患者與對照組中分布截然不同(p＝0.001)，與cc基因型相比，gc基因型的or是1.69(1.15-2.49)，gg基因型的or是6.48(1.87-22.43)。與c等位基因相比，g等位基因的or是2.31(0.48-11)。gg和gc基因型和g等位基因與兩種進(jìn)展型老年性黃斑變性都顯著相關(guān)，攜帶gg基因型的個體比攜帶cc基因型的個體發(fā)展成老年性黃斑變性的風(fēng)險要高6倍，對于進(jìn)展性老年性黃斑變性(滲出性和地圖樣萎縮)補(bǔ)體因子c3是一個相對強(qiáng)烈的易感基因。
9、鑒于以上研究，專門靶向針對補(bǔ)體因子c3的小分子藥物pegcetacoplan被開發(fā)用于地圖樣萎縮。
10、2、補(bǔ)體因子c3與腫瘤
11、補(bǔ)體因子c3基因與肺癌、胃癌、卵巢癌、皮膚癌等多種腫瘤疾病的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。
12、腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。研究證實(shí)在腫瘤微環(huán)境中補(bǔ)體激活具有免疫調(diào)控作用。補(bǔ)體對腫瘤細(xì)胞可以發(fā)揮截然不同的兩種作用：抗腫瘤效應(yīng)，表現(xiàn)為膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)控蛋白、溶細(xì)胞膜攻擊復(fù)合物低表達(dá)和中等的c5a濃度；促腫瘤效應(yīng)，表現(xiàn)為膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)控蛋白、亞溶解型溶細(xì)胞膜攻擊復(fù)合物高表達(dá)和高濃度的c5a。
13、多種類型的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體激活的失衡和補(bǔ)體蛋白的沉積。肺癌、胃癌個體中，c3a的mrna水平和蛋白水平均都顯著升高。當(dāng)阻斷或沉默補(bǔ)體因子c3、c5a或其受體或膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)控蛋白后，腫瘤的遷移、增殖受抑，疾病進(jìn)展和患者的生存率都有所改善。在補(bǔ)體因子c3缺陷小鼠，原發(fā)肺癌和轉(zhuǎn)移癌都受到了強(qiáng)烈的抑制，甚至在許多個體中檢測不到腫瘤存在。這種生長抑制與ifnγ+/tnfα+/il10+cd4+和cd8+t細(xì)胞數(shù)量增加相關(guān)。在多種原位接種腫瘤細(xì)胞系的模型，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體因子c3/c3受體自分泌信號傳導(dǎo)環(huán)路參與了腫瘤生長的調(diào)控。這些證據(jù)都表明在肺癌進(jìn)展過程中，補(bǔ)體激活是一個重要的調(diào)控因素，通過補(bǔ)體因子c3依賴的方式驅(qū)動免疫逃逸。這些結(jié)果證明了補(bǔ)體因子c3在腫瘤中發(fā)揮了作用，可以作為生物標(biāo)志物和這類轉(zhuǎn)移性腫瘤的潛在的治療靶標(biāo)。
14、專利us20080090997a1中，序列557和549分別與本專利中序列6和9相同，但是經(jīng)檢索，該專利描述中對應(yīng)序列均為靶向trpv1(nm_080704)，該序列并非c3?mrna序列。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)針對補(bǔ)體c3因子的mrna設(shè)計特異性sirna，將其遞送到目的細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)對補(bǔ)體c3因子表達(dá)的抑制，為確證c3因子表達(dá)增加為致病因素或參與因素的疾病的治療提供新的思路。
2、為了檢測本專利技術(shù)提及的補(bǔ)體c3因子對應(yīng)的sirna的抑制效果，針對c3因子先后制備了16種sirna。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，首先將制備的sirna遞送至培養(yǎng)的細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后預(yù)定時間收集細(xì)胞樣品、提取rna；將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna后，利用實(shí)時定量pcr方法獲得ct值。通過對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，獲得c3mrna的相對表達(dá)情況，從而比較各條sirna對c3?mrna表達(dá)的抑制效果。
3、本專利技術(shù)的第一方面，提供了一種靶向補(bǔ)體c3因子編碼基因的干擾rna。
4、優(yōu)選的，所述的干擾rna抑制補(bǔ)體c3因子的表達(dá)。
5、優(yōu)選的，所述的干擾rna可以通過現(xiàn)有技術(shù)中任意方式獲得，例如化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、酶消化法或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法。
6、在本專利技術(shù)的一個具體實(shí)施方式中，所述的干擾rna是化學(xué)合成的。
7、優(yōu)選的，所述的干擾rna包含seq?id?no：1-36中任一個或兩個以上(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36個)所示的核苷酸序列。
8、優(yōu)選的，所述的干擾rna由seq?id?no：1-36中任一個或兩個以上(例如1、2、3、4、5、6、7、本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種靶向補(bǔ)體C3因子編碼基因的干擾RNA，其特征在于，所述的干擾RNA包含SEQ?IDNO：1-36中任一個或兩個以上所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾RNA，其特征在于，所述的干擾RNA包含正義鏈和/或反義鏈；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的干擾RNA，其特征在于，所述的干擾RNA包含下列任一組：
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的干擾RNA，其特征在于，所述的干擾RNA還包含懸掛堿基；
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的干擾RNA，其特征在于，所述的干擾RNA包含siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA或miRNA中一種或兩種以上的組合；
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的干擾RNA，其特征在于，所述的干擾RNA還包括至少一種修飾；所述的修飾包括在堿基、糖環(huán)和/或磷酸骨架上進(jìn)行的修飾；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的干擾RNA，其特征在于，所述的修飾還包括具有肌苷、辮苷、黃嘌呤、2'-甲基核糖、非天然磷酸二酯鍵(如甲基膦酸酯、硫代膦酸酯)和/或肽的核苷酸。
8.一種權(quán)利要求1-7任一
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的載體為病毒載體或非病毒載體；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述脂質(zhì)納米顆粒/脂質(zhì)體包括：陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、聚乙二醇脂質(zhì)、甾族脂質(zhì)或陰離子脂質(zhì)中的一種或兩種以上組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)包括：十八酰胺(SA)、溴化月桂基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨、溴化肉豆蔻基三甲基銨、溴化二甲基二-十八銨(DDAB)、[(4-羥基丁基)氮雜二烷基]雙(己烷-6，1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-三甲基銨-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基銨-丙烷、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]膽固醇(DC膽固醇)、二甲基二十八烷基銨(DDA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)、二棕櫚酰(C16:0)三甲基銨丙烷(DPTAP)、二硬脂酰基三甲基銨丙烷(DSTAP)、N-[1-(2,3-二烯丙氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、1,2-二油酰基-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、1,2-二亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二-十四酰基-3-二甲基銨-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基銨-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基銨-丙烷、1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基銨)-丁酰基-sn-甘油(DOTB)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、SAINT-2、聚陽離子脂質(zhì)2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述中性脂質(zhì)包括：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、油酰磷脂酰膽堿(POPC)、1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的一種或兩種以上的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述聚乙二醇脂質(zhì)包括：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕櫚油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)、
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述聚乙二醇脂質(zhì)為單一分子量的聚乙二醇脂...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種靶向補(bǔ)體c3因子編碼基因的干擾rna，其特征在于，所述的干擾rna包含seq?idno：1-36中任一個或兩個以上所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾rna，其特征在于，所述的干擾rna包含正義鏈和/或反義鏈；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的干擾rna，其特征在于，所述的干擾rna包含下列任一組：
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的干擾rna，其特征在于，所述的干擾rna還包含懸掛堿基；
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的干擾rna，其特征在于，所述的干擾rna包含sirna、dsrna、shrna、airna或mirna中一種或兩種以上的組合；
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的干擾rna，其特征在于，所述的干擾rna還包括至少一種修飾；所述的修飾包括在堿基、糖環(huán)和/或磷酸骨架上進(jìn)行的修飾；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的干擾rna，其特征在于，所述的修飾還包括具有肌苷、辮苷、黃嘌呤、2'-甲基核糖、非天然磷酸二酯鍵(如甲基膦酸酯、硫代膦酸酯)和/或肽的核苷酸。
8.一種權(quán)利要求1-7任一所述的干擾rna的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的遞送系統(tǒng)包含權(quán)利要求1-7任一所述的干擾rna和載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的載體為病毒載體或非病毒載體；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述脂質(zhì)納米顆粒/脂質(zhì)體包括：陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、聚乙二醇脂質(zhì)、甾族脂質(zhì)或陰離子脂質(zhì)中的一種或兩種以上組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)包括：十八酰胺(sa)、溴化月桂基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨、溴化肉豆蔻基三甲基銨、溴化二甲基二-十八銨(ddab)、[(4-羥基丁基)氮雜二烷基]雙(己烷-6，1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(alc-0315)、1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基銨基)丙烷(dotap)、1,2-二-(9z-十八烯酰基)-3-三甲基銨-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基銨-丙烷、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]膽固醇(dc膽固醇)、二甲基二十八烷基銨(dda)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨丙烷(dmtap)、二棕櫚酰(c16:0)三甲基銨丙烷(dptap)、二硬脂酰基三甲基銨丙烷(dstap)、n-[1-(2,3-二烯丙氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)、n,n-二油酰基-n,n-二甲基氯化銨(dodac)、1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-乙基磷酸膽堿(doepc)、1,2-二油酰基-3-二甲基銨丙烷(dodap)、1,2-二亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二-十四酰基-3-二甲基銨-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基銨-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基銨-丙烷、1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基銨)-丁酰基-sn-甘油(dotb)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、saint-2、聚陽離子脂質(zhì)2,3-二油酰基氧基-n-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(dospa)、
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述中性脂質(zhì)包括：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(dspc)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(dppc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dmpe)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dopg)、油酰磷脂酰膽堿(popc)、1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)中的一種或兩種以上的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述聚乙二醇脂質(zhì)包括：2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-二十四烷基乙酰胺(alc-0159)1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(peg-dmg)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](peg-dspe)、peg-二甾醇基甘油(peg-dsg)、peg-...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：賈宏麗，林美娜，楊脈，陳曉萌，趙宣，
申請(專利權(quán))人：北京鍵凱科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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