【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial?virus，rsv)的重組亞單位疫苗及其應(yīng)用，更具體涉及包含rsv病毒包膜融合蛋白f的head?only(rhf)結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域例如免疫球蛋白fc片段的重組融合蛋白，包含所述重組融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建體，所述重組融合蛋白的制備方法，以及包括該重組融合蛋白的免疫原性組合物，例如疫苗。
技術(shù)介紹
0、專(zhuān)利技術(shù)背景
1、呼吸道合胞病毒(respiratory?syncytial?virus，rsv)易感人群包括兒童、老人和免疫力低下人群，其中兒童是主要受感染人群，年滿2周歲時(shí)超過(guò)95％的兒童都感染過(guò)rsv。全球范圍內(nèi)，rsv感染是導(dǎo)致1個(gè)月至1歲的兒童死亡的主要原因，危害僅次于瘧疾。rsv感染可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道癥狀，如毛細(xì)支氣管炎、肺炎喉炎、氣管炎、哮喘等。老年人感染rsv常導(dǎo)致阻塞性肺病惡化且伴有心肺并發(fā)癥。每年與rsv病毒感染相關(guān)的治療和護(hù)理成本達(dá)數(shù)十億美元，給全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)和挑戰(zhàn)。
2、臨床上，帕麗珠單抗(palivizumab)目前用于預(yù)防由rsv感染引起的嚴(yán)重疾病，特別是在早產(chǎn)或患先天性心臟病的嬰幼兒中，但價(jià)格昂貴；尼塞維單抗(nirsevimab)于近期分別獲歐洲藥品管理局(ema)和美國(guó)食品藥品管理局(fda)批準(zhǔn)用于預(yù)防所有嬰幼兒人群rsv相關(guān)下呼吸道疾病；利巴韋林被批準(zhǔn)用于治療嬰幼兒rsv病毒感染所致的細(xì)支氣管炎及肺炎，但療效有限且副作用巨大。在疫苗方面，盡管有一些處于
3、rsv是一種包膜非節(jié)段負(fù)鏈rna病毒，屬于肺炎病毒科(pneumoviridae)，正肺病毒屬(orthopneumovirus)。rsv基因組共編碼11種蛋白，其中g(shù)和f表面蛋白在rsv病毒吸附和融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體最重要的抗原靶標(biāo)，也是rsv病毒疫苗開(kāi)發(fā)的主要靶點(diǎn)。rsv病毒的f蛋白是病毒包膜上豐富的i類(lèi)融合糖蛋白，以三聚體“融合前”(prefusion)狀態(tài)存在于病毒表面。一旦病毒開(kāi)始侵染細(xì)胞，f蛋白的疏水融合環(huán)將插入宿主細(xì)胞膜，并經(jīng)歷廣泛的構(gòu)象變化，以折疊成能量上有利的三聚體“融合后”(postfusion)狀態(tài)。
4、研究結(jié)果表明，相比融合后構(gòu)象狀態(tài)的f蛋白，穩(wěn)定在融合前構(gòu)象的f蛋白可以在動(dòng)物模型中激活更強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)。例如，先前顯示包含“ds-cav1”取代(155c、290c、190f和207l)、半胱氨酸拉鏈(cysteine?zipper)和“sc-dm”取代(n67i，s215p)的重組rsv病毒f胞外域三聚體在動(dòng)物模型中引發(fā)的中和抗體應(yīng)答遠(yuǎn)高于基于融合后f蛋白制備的免疫原所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答(structure-based?design?of?a?fusion?glycoprotein?vaccinefor?respiratory?syncytial?virus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4461862/)；a?cysteine?zipper?stabilizes?a?pre-fusion?f?glycoprotein?vaccinefor?respiratory?syncytial?virus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4476739/)；a?highly?stable?prefusion?rsv?f?vaccine?derived?from?structuralanalysis?of?the?fusion?mechanism(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4569726/))。此外，人體rsv自然感染產(chǎn)生的中和免疫反應(yīng)中，大部分是特異于融合前構(gòu)象f蛋白的抗體，且通常是針對(duì)融合前構(gòu)象f蛋白三聚體遠(yuǎn)膜端頭部區(qū)域的強(qiáng)效抗原表位ф(zero)(neutralizing?antibodies?against?the?preactive?form?of?respiratorysyncytial?virus?fusion?protein?offer?unique?possibilities?for?clinicalintervention(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3286924/))。
5、目前臨床在研和獲批上市的rsv疫苗均主要以融合前構(gòu)象的f全長(zhǎng)蛋白為抗原靶標(biāo)，采用了重組蛋白、mrna和病毒載體疫苗等技術(shù)路線。基于f全長(zhǎng)蛋白的重組rsv疫苗由于抗原可能轉(zhuǎn)變?yōu)槿诤虾髽?gòu)象而需進(jìn)行凍干處理，mrna疫苗通常需在-20℃甚至-70℃以下儲(chǔ)存和運(yùn)輸，病毒載體疫苗則存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低且免疫原性不佳等缺陷。因此，本領(lǐng)域仍需開(kāi)發(fā)安全有效、質(zhì)量穩(wěn)定的rsv疫苗，更理想的是能夠聚焦強(qiáng)效抗原表位ф(zero)的rsv疫苗。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
0、專(zhuān)利技術(shù)簡(jiǎn)述
1、在一方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種重組融合蛋白，其包含呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f的head?only(rhf)結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域。
2、在一些實(shí)施方案中，所述rsv?f蛋白的rhf結(jié)構(gòu)域包含rsv病毒強(qiáng)效抗原表位ф(zero)。
3、在一些實(shí)施方案中，所述重組融合蛋白的rsv強(qiáng)效抗原表位ф(zero)被維系在融合前構(gòu)象狀態(tài)。
4、在一些實(shí)施方案中，所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f選自a亞型人rsv病毒f蛋白、b亞型人rsv病毒f蛋白或牛rsv病毒f蛋白，優(yōu)選地，所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f是a亞型a2株人rsv病毒f蛋白。
5、在一些實(shí)施方案中，所述rhf結(jié)構(gòu)域包含rsv?f蛋白的第一片段和第二片段，所述第一片段包含rsv?f蛋白的約第50位-約第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv?f蛋白的約第145位-約第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置參考seq?id?no:1。
6、在一些實(shí)施方案中，所述rhf結(jié)構(gòu)域包含rsv?f蛋白的第一片段和第二片段，
7、1)所述第一片段包含rsv?f蛋白的第50位-第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv?f蛋白的第145位-第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置參考seq?id?no:1；
8、2)所述第一片段包含rsv?f蛋白的第50位-第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv?f蛋白的第145位-第305位的氨基酸序列，所述氨基酸位置參考seq?id?no:1；
9、3)所述第一片段包含rsv?f蛋白的第50位-第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv?f蛋白的第1本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種重組融合蛋白，其包含呼吸道合胞病毒(RSV)包膜融合蛋白F的Head?only(RHF)結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的重組融合蛋白，其中所述RSV?F蛋白的RHF結(jié)構(gòu)域包含RSV病毒強(qiáng)效抗原表位Ф(Zero)。
3.權(quán)利要求2的重組融合蛋白，其中所述重組融合蛋白的RSV強(qiáng)效抗原表位Ф(Zero)被維系在融合前構(gòu)象狀態(tài)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述呼吸道合胞病毒(RSV)包膜融合蛋白F選自A亞型人RSV?F蛋白、B亞型人RSV?F蛋白或牛RSV?F蛋白，優(yōu)選地，所述呼吸道合胞病毒(RSV)包膜融合蛋白F是A亞型A2株人RSV病毒F蛋白。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述RHF結(jié)構(gòu)域包含RSV?F蛋白的第一片段和第二片段，所述第一片段包含RSV?F蛋白的約第50位-約第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含RSV?F蛋白的約第145位-約第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置參考SEQ?ID?NO:1。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述RHF結(jié)構(gòu)
7.權(quán)利要求6的重組融合蛋白，其中所述第一片段包含SEQ?ID?NO:4所示氨基酸序列，且所述第二片段包含SEQ?ID?NO:5所示氨基酸序列；或所述第一片段包含SEQ?ID?NO:6所示氨基酸序列，且所述第二片段包含SEQ?ID?NO:7所示氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述第一片段和第二片段通過(guò)接頭相連。
9.權(quán)利要求8的重組融合蛋白，其中所述接頭是長(zhǎng)度為約3-約21個(gè)氨基酸的肽接頭。
10.權(quán)利要求9的重組融合蛋白，其中所述肽接頭是G(SG)n或G(PG)n或G(AG)n，其中n為1-10之間的整數(shù)，例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
11.權(quán)利要求9或10的重組融合蛋白，其中所述肽接頭選自GSG、GSGSG、GSGSGSGSG、GPGPG、GAGAG。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述RHF結(jié)構(gòu)域包含：
13.權(quán)利要求12的重組融合蛋白，其中所述RHF結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列包含氨基酸取代
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述RHF結(jié)構(gòu)域還進(jìn)一步包含在第67位的I(67I)和/或在第215位的P(215P)，所述氨基酸位置參考SEQ?ID?NO:1。
15.權(quán)利要求14的重組融合蛋白，其中所述RHF結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列還進(jìn)一步包含氨基酸取代N67I和/或S215P，所述氨基酸位置參考SEQ?ID?NO:1。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述RHF結(jié)構(gòu)域包含SEQ?ID?NO:8-10之一所示的氨基酸序列或與SEQ?ID?NO:8-10之一具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列相同性的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域直接或通過(guò)接頭連接至所述RHF結(jié)構(gòu)域的C末端。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中多聚化結(jié)構(gòu)域選自免疫球蛋白的Fc片段、T4噬菌體的Foldon序列、鐵蛋白(Ferritin)亞基。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述多聚化序列是T4噬菌體的Foldon序列，例如，所述T4噬菌體的Foldon序列包含SEQ?ID?NO:11所示氨基酸序列。
20.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白的Fc片段。
21.權(quán)利要求20的重組融合蛋白，其中所述免疫球蛋白的Fc片段是人、小鼠、兔子、牛、山羊、豬、兔、倉(cāng)鼠、大鼠、或豚鼠的免疫球蛋白的Fc片段；或
22.權(quán)利要求20或21的重組融合蛋白，所述免疫球蛋白Fc片段包含SEQ?ID?NO:12或13所示氨基酸序列。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述重組融合蛋白包含SEQ?ID?NO:14-22之一所示的氨基酸序列或與SEQ?ID?NO:14-22之一具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列相同性的氨基酸序列。
24.一種分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)所述的重組融合蛋白的核苷酸序列。
25.權(quán)利要求24的分離的核酸分子，其中所述編碼權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)所述的重組融合蛋白的核苷酸序列針對(duì)用于...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組融合蛋白，其包含呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f的head?only(rhf)結(jié)構(gòu)域和多聚化結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的重組融合蛋白，其中所述rsv?f蛋白的rhf結(jié)構(gòu)域包含rsv病毒強(qiáng)效抗原表位ф(zero)。
3.權(quán)利要求2的重組融合蛋白，其中所述重組融合蛋白的rsv強(qiáng)效抗原表位ф(zero)被維系在融合前構(gòu)象狀態(tài)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f選自a亞型人rsv?f蛋白、b亞型人rsv?f蛋白或牛rsv?f蛋白，優(yōu)選地，所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f是a亞型a2株人rsv病毒f蛋白。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述rhf結(jié)構(gòu)域包含rsv?f蛋白的第一片段和第二片段，所述第一片段包含rsv?f蛋白的約第50位-約第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv?f蛋白的約第145位-約第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置參考seq?id?no:1。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述rhf結(jié)構(gòu)域包含rsv?f蛋白的第一片段和第二片段，
7.權(quán)利要求6的重組融合蛋白，其中所述第一片段包含seq?id?no:4所示氨基酸序列，且所述第二片段包含seq?id?no:5所示氨基酸序列；或所述第一片段包含seq?id?no:6所示氨基酸序列，且所述第二片段包含seq?id?no:7所示氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述第一片段和第二片段通過(guò)接頭相連。
9.權(quán)利要求8的重組融合蛋白，其中所述接頭是長(zhǎng)度為約3-約21個(gè)氨基酸的肽接頭。
10.權(quán)利要求9的重組融合蛋白，其中所述肽接頭是g(sg)n或g(pg)n或g(ag)n，其中n為1-10之間的整數(shù)，例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
11.權(quán)利要求9或10的重組融合蛋白，其中所述肽接頭選自gsg、gsgsg、gsgsgsgsg、gpgpg、gagag。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述rhf結(jié)構(gòu)域包含：
13.權(quán)利要求12的重組融合蛋白，其中所述rhf結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列包含氨基酸取代
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述rhf結(jié)構(gòu)域還進(jìn)一步包含在第67位的i(67i)和/或在第215位的p(215p)，所述氨基酸位置參考seq?id?no:1。
15.權(quán)利要求14的重組融合蛋白，其中所述rhf結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列還進(jìn)一步包含氨基酸取代n67i和/或s215p，所述氨基酸位置參考seq?id?no:1。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述rhf結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no:8-10之一所示的氨基酸序列或與seq?id?no:8-10之一具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列相同性的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域直接或通過(guò)接頭連接至所述rhf結(jié)構(gòu)域的c末端。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中多聚化結(jié)構(gòu)域選自免疫球蛋白的fc片段、t4噬菌體的foldon序列、鐵蛋白(ferritin)亞基。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的重組融合蛋白，...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔣敦泉，劉永江，張士彬，黃培鑫，陳君娜，陰雅潔，劉玉瑩，張歡，江萍，銀飛，姜緒林，張堯，沈邇萃，楊秀芬，王艷，高俊，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
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