【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測領域，具體涉及用于菌種定量檢測的引物探針組合、試劑盒及應用。
技術介紹
1、細胞治療(cell?therapy)通常是指利用患者自體(或異體)的成體細胞(或干細胞)對組織、器官進行修復的治療方法，目前已廣泛用于骨髓移植、晚期肝硬化、股骨頭壞死、惡性腫瘤、心肌梗死等疾病。
2、細胞治療產品的無菌檢查法分為《中華人民共和國藥典》2020版中1101無菌檢查法、基于微生物生長的無菌快檢測技術和非基于生物生長的無菌快檢測技術。傳統無菌檢查法使用的培養基的種類、培養溫度和培養時間的選定是折中妥協的結果，并非所有微生物都能在此條件下良好的生長。現有資料顯示，在《usp〈1071〉無菌短貨架期產品放行的快速微生物檢查法:依據風險評估的方法》中提及傳統無菌檢查14天的培養時間無法滿足短效期藥品效期的需求。依據微生物生長情況對結果作出評判的無菌檢查法至少需要14天的培養周期，該法不適用于那些短貨架期產品或即制即用產品。而根據《歐洲藥典》2.6.27中提及如果生物制品貨架期非常短(如幾小時)或標準方法不能獲得滿意的微生物檢查，可采用不基于微生物生長的直接檢測法“2.6.21核酸擴增技術”、“2.7.24流式細胞術”、“生物發光技術5.6-1微生物質量控制的替代方法”，與基于微生物生長方法比較，此類方法可以解決在很短的時間內給出檢測結果。活菌或非活菌均可采用此種方法檢測。
3、細胞治療產品成分復雜，質量要求高，同時存在多種待檢項，如細菌、真菌等，如何實現對多種微生物污染的樣本的高靈敏度檢測仍是本領域亟待解
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種用于菌種定量檢測的引物探針組合，可實現對可能存在多種微生物污染的樣本的高靈敏度地檢測，為細胞制劑無菌快檢領域提供了一種有效的檢測方法。
2、本專利技術的具體技術方案如下：
3、用于菌種定量檢測的引物探針組合，所述菌種包括真菌和細菌，其中，真菌檢測包括如seq?id?no.3所示引物1、如seq?id?no.6所示引物2和如seq?id?no.9所示的檢測探針；細菌檢測包括如seq?id?no.12所示引物1、如seq?id?no.15所示引物2和如seq?id?no.18所示的檢測探針。
4、在一些實施方案中，所述檢測探針的5’端還偶聯有第一熒光標記，3’端還偶聯有淬滅基團。
5、在一些實施方案中，所述第一熒光標記選自fam、joe、tet、hex、vic、cy3、quasar570、rox、txrd、cy5、quasar?670或cy5.5；所述熒光淬滅基團選自bhq-1、bhq-2、bhq-3或tamra。
6、在一些具體的實施方案中，所述第一熒光標記為fam，所述熒光淬滅基團為bhq-1。
7、在一些實施方案中，所述引物1、引物2、和檢測探針的摩爾比為1-5:1-5:0.5-2。
8、在一些具體的實施方案中，引物1、引物2、和檢測探針摩爾比為2:2:1。
9、在一些具體的實施方案中，所述引物1、引物2和檢測探針的終濃度分別為9-11μm、9-11μm和4-6μm。
10、本專利技術公開的引物探針組合可用于檢測帶有16srrna基因的真菌和/或細菌，其中，真菌選自酵母菌、霉菌、雙相型真菌、類真菌，細菌選自假單胞菌、軍團菌、不動桿菌、腸桿菌、細球菌、鏈球菌、消化球菌、芽孢桿菌、放線菌、類桿菌、放線菌、分枝桿菌、梭菌。
11、在一些具體的實施方案中，所述真菌選自酵母菌、霉菌，所述細菌選自假單胞菌、細球菌、芽孢桿菌、梭菌。
12、在一些具體的實施方案中，所述真菌選自白色念珠菌、黑曲霉；所述細菌選自金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌。
13、本專利技術同時提供一種用于菌種定量檢測的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的引物探針組合。
14、在一些實施方案中，所述試劑盒的pcr反應體系為：taq酶預混液，引物探針組合，待測樣品dna，蒸餾水，其中，taq酶預混液、引物探針組合和待測樣品dna的體積比為10:2:1；優選地，taq酶預混液的用量為2×，引物探針組合的濃度為10μm。
15、在一些實施方案中，應用所述試劑盒的pcr反應程序為：95℃預變性5min，共1個循環；95℃變性30s，60℃退火延伸30s，共40個循環。
16、本專利技術還提供一種不以疾病診斷和治療為目的的定量檢測菌體的方法，所述方法采用如上所述的試劑盒，用于定量檢測采樣樣品、生物制品中的細菌和/或真菌污染。
17、在一些實施方案中，所述方法包括以下步驟：
18、1)制備不同濃度梯度的標準菌懸液，分別應用上述試劑盒進行pcr檢測，建立菌體濃度對數值與循環數閾值(ct值)關系的標準曲線；
19、2)從待測樣本提取dna為模板，應用上述試劑盒進行pcr檢測；
20、3)當待測樣本的ct值為10～38，且空白對照的ct值大于40時，將待測樣本的ct值代入標準曲線計算，即得待測樣本中所含的菌體數量。
21、本專利技術的有益效果在于：
22、本專利技術針對廣泛存在在細菌和真菌體內的16srrna基因，設計了具有高針對性、高靈敏度的引物探針組合，基于實時熒光定量pcr(quantitative?real-time?pcr，qpcr)方法，可以快速檢出無菌細胞制劑中的污染物，縮短細胞制劑產品放行周期，也可以用于中間產品的無菌檢查或者有被污染風險產品的無菌檢查，快速得到檢測結果，對產品在制備、過程中污染控制，無菌保障，產品的放行提供重要參考依據。
23、本專利技術針對的菌種為《中華人民共和國藥典》2020版，1101無菌檢查章節中涉及到的微生物(細菌和真菌)，這些微生物對細胞產品放行的影響，因檢測周期較長一般需要14天，基于細胞制劑時效性影響比較大，具有實際的應用價值。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.用于菌種定量檢測的引物探針組合，其特征在于，所述菌種包括真菌和細菌，其中，真菌檢測包括如SEQ?ID?NO.3所示引物1、如SEQ?ID?NO.6所示引物2和如SEQ?ID?NO.9所示的檢測探針；細菌檢測包括如SEQ?ID?NO.12所示引物1、如SEQ?ID?NO.15所示引物2和如SEQID?NO.18所示的檢測探針。
2.如權利要求2所述的引物探針組合，其特征在于，所述檢測探針的5’端偶聯有第一熒光標記，3’端偶聯有熒光淬滅基團。
3.如權利要求3所述的引物探針組合，其特征在于，所述第一熒光標記選自FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Cy3、Quasar?570、ROX、TxRd、Cy5、Quasar?670或Cy5.5；所述熒光淬滅基團選自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或TAMRA；優選地，所述第一熒光標記為FAM，所述熒光淬滅基團為BHQ-1。
4.如權利要求2-4任一項所述的引物探針組合，其特征在于，所述引物1、引物2、和檢測探針的摩爾比為1-5:1-5:0.5-2，優選為2:2:1。
5.如權利要求4所述
6.如權利要求1-5任一項所述的引物探針組合，其特征在于，所述菌種選自帶有16SrRNA基因的真菌和/或細菌，其中，真菌選自酵母菌、霉菌、雙相型真菌、類真菌，細菌選自假單胞菌、軍團菌、不動桿菌、腸桿菌、細球菌、鏈球菌、消化球菌、芽孢桿菌、放線菌、類桿菌、放線菌、分枝桿菌、梭菌；
7.用于菌種定量檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1-6任一項所述的引物探針組合。
8.如權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的PCR反應體系為：Taq酶預混液，引物探針組合，待測樣品DNA，蒸餾水，其中，Taq酶預混液、引物探針組合和待測樣品DNA的體積比為10:2:1；反應程序為：95℃預變性5min，共1個循環；95℃變性30s，60℃退火延伸30s，共40個循環；
9.一種不以疾病診斷和治療為目的的定量檢測菌體的方法，其特征在于，采用權利要求7或8所述的試劑盒，用于定量檢測采樣樣品、生物制品中的細菌和/或真菌污染。
10.如權利要求9所述的定量檢測菌體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
...【技術特征摘要】
1.用于菌種定量檢測的引物探針組合，其特征在于，所述菌種包括真菌和細菌，其中，真菌檢測包括如seq?id?no.3所示引物1、如seq?id?no.6所示引物2和如seq?id?no.9所示的檢測探針；細菌檢測包括如seq?id?no.12所示引物1、如seq?id?no.15所示引物2和如seqid?no.18所示的檢測探針。
2.如權利要求2所述的引物探針組合，其特征在于，所述檢測探針的5’端偶聯有第一熒光標記，3’端偶聯有熒光淬滅基團。
3.如權利要求3所述的引物探針組合，其特征在于，所述第一熒光標記選自fam、joe、tet、hex、vic、cy3、quasar?570、rox、txrd、cy5、quasar?670或cy5.5；所述熒光淬滅基團選自bhq-1、bhq-2、bhq-3或tamra；優選地，所述第一熒光標記為fam，所述熒光淬滅基團為bhq-1。
4.如權利要求2-4任一項所述的引物探針組合，其特征在于，所述引物1、引物2、和檢測探針的摩爾比為1-5:1-5:0.5-2，優選為2:2:1。
5.如權利要求4所述的引物探針組合，其特征在于，所述引物1、引物2和...
【專利技術屬性】
技術研發人員：果連營，韓東雷，畢根彪，韓忠陽，徐增輝，
申請(專利權)人：北京細胞治療集團有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。