【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫學，更具體地，涉及一種基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法、系統、設備、介質和程序產品。
技術介紹
1、目前的醫療，特別是個性化或精準醫療，越來越依賴于dna分析。臨床樣品中的dna越來越多地用于尋找疾病的診斷，預后和預測生物標志物。隨著測序技術的發展，二代和三代測序在疾病研究、臨床診斷和個體化醫療中發揮著重要作用。基因檢測已經成為科學研究和醫學實踐中不可或缺的工具。相比于全基因組測序(whole?genome?sequencing，wgs)，靶向測序技術旨在對特定基因區域或基因組內特定序列進行快速、準確的測序分析。通過引入特定的引物或探針，靶向測序能夠選擇性地放大和測序感興趣的基因區域。這種精準的方法在研究遺傳變異、致病基因的發現、腫瘤基因突變分析、病原微生物及其耐藥基因檢測等方面發揮著重要作用。
2、目前最常用的基因捕獲方法包括探針雜交捕獲技術和多重pcr擴增技術。其中，探針雜交捕獲技術利用核酸堿基互補配對的原理，根據研究需求，設計針對特定基因組區域的帶修飾探針，與加上測序接頭的核酸文庫進行雜交，使探針與目標dna序列特異性結合。探針與目標區域形成的復合物可通過磁珠或其他方法回收，將目標區域從整個dna樣本中捕獲出來。雖然相對于全基因組測序來說，探針雜交捕獲測序通常成本較低，但受制于探針設計和合成等成本，其整個捕獲流程成本依然較高。此外，探針雜交捕獲技術還有著操作復雜、耗時長等缺點。多重pcr擴增技術是一種在單個反應中同時擴增多個目標序列的pcr技術。它通過在同一反應中同時引入
3、此外，近年來，隨著crispr/cas(clustered?regularly?interspaced?shortpalindromic?repeats(crispr)/crispr-associatedprotein)系統的發展，其應用已經不再局限于基因編輯領域。crispr/cas9系統可通過sgrna靶向目標序列進行切割，并通過切割后連接某種修飾用于分離目標片段。但這種切割的策略通常需要對樣本核酸進行末端鈍化等前處理，操作繁瑣；且對sgrna的位置選擇通常有諸多限制，如sgrna(single?guiderna)間隔過小會導致目標序列被cas9切割過于碎片化影響核酸回收效率。上述缺點限制了crispr/cas9系統在核酸捕獲檢測領域更廣泛的應用。經過改造后的dcas9，即失活型cas9(dead?cas9，dcas9)，雖然失去了核酸酶活性，但保留dna結合能力，為crispr/cas系統應用于核酸捕獲領域帶來了新的可能性。通常情況下，dcas9多應用于基因表達調控和表觀修飾等研究中。通過在dcas9的c端融合各種具有轉錄調控功能的結構域，可招募轉錄因子或者修飾目標區域，從而研究目標基因的轉錄調控。目前，dcas9在轉錄調控方面已得到了廣泛應用，但其在核酸捕獲領域的潛在應用仍需進一步探索。
技術實現思路
1、本專利技術旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本專利技術提供一種基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法及其系統；本專利技術方法通過利用缺失核酸酶活性而保留dna結合能力的失活型cas9(dead?cas9，dcas9)與sgrna組成復合物對提取后核酸直接進行靶序列的捕獲。生物素等標記的dcas9與sgrna形成的復合物可特異性與目標靶序列結合，再利用鏈霉親和素等捕獲方法實現對靶序列的有效富集。本專利技術解決現有靶向測序操作復雜、耗時長、成本高、無法直接對超長和超短核酸進行捕獲等問題。
2、本申請第一方面公開一種基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法，所述方法包括：
3、獲取包含有靶序列的dna序列；所述靶序列包括：200-1000bp的序列、大于等于1000bp的序列、小于等于200bp的序列；
4、獲取dcas9-sgrna復合物；
5、混合所述dna序列和所述dcas9-sgrna復合物，所述dcas9-sgrna復合物捕獲所述dna序列中的靶序列，得到dcas9-sgrna復合物與靶序列相結合的dcas9-sgrna-dna復合物。
6、在一些實施例中，所述靶序列包括：大于等于10kb的序列；
7、可選的，所述靶序列包括：60-120bp的序列；優選包括：以下任一種長度的序列：60bp、80bp、100bp、120bp。
8、在一些實施例中，所述dcas9-sgrna復合物的獲取方法包括：
9、獲取sgrna；
10、按照指定間隔長度從所述sgrna中確定目標sgrna；
11、獲取所述目標sgrna的正向引物和反向引物；
12、基于所述正向引物和反向引物，利用pcr技術合成體外轉錄用使用的模板dna，得到pcr產物；
13、對pcr產物進行純化處理，得到純化后的sgrna；
14、按照體系混合標準組裝所述純化后的sgrna，得到所述dcas9-sgrna復合物；
15、可選的，所述指定間隔長度包括以下任一種或幾種：20bp、100bp、200bp；
16、可選的，所述獲取sgrna中sgrna通過以下方法得到：確定靶序列；根據pam序列確定所述靶序列上的sgrna；從所述靶序列上的sgrna中篩選出符合要求的sgrna即為所述sgrna；
17、可選的，所述篩選的標準包括以下任一種或幾種：gc含量在區間內、均聚物小于等于第一閾值、雙核甘酸重復小于等于第二閾值、無發夾結構、無人基因組脫靶；
18、可選的，所述純化處理包括：利用固相介質純化所述pcr產物，得到純化后的sgrna模板dna；利用體外轉錄試劑盒進行體外轉錄，去除模板dna，得到體外轉錄sgrna；利用rna純化試劑盒純化所述體外轉錄sgrna，得到所述純化后的sgrna；
19、可選的，所述體系混合標準包括以下組分：sgrna、dcas9-biotin、反應緩沖液、無核酸酶水。
20、在一些實施例中，所述dcas9-sgrna復合物包括無核酸酶活性的cas9蛋白與sgrna結合形成的復合物；
21、可選的，所述dcas9蛋白包括常規dcas9蛋白以及經過其他改造過程形成的各種dcas9蛋白。
22、在一些實施例中，所述包含有靶序列的dna序列來自以下任一種或幾種樣本：人源細胞、鮑曼不動桿菌acinetobacterbaumanniiatcc?19606、肺炎克雷伯菌klebsiellapneumoniaeatcc?43816、大腸桿菌escherichia?co本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述靶序列包括：大于等于10kb的序列；
3.根據權利要求1所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述dCas9-sgRNA復合物的獲取方法包括：
4.根據權利要求1所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述dCas9-sgRNA復合物包括無核酸酶活性的Cas9蛋白與sgRNA結合形成的復合物；
5.根據權利要求1-4任一項所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述包含有靶序列的DNA序列來自以下任一種或幾種樣本：人源細胞、鮑曼不動桿菌Acinetobacter?baumannii?ATCC?19606、肺炎克雷伯菌Klebsiella?pneumoniae?ATCC43816、大腸桿菌Escherichia?coli?ATCC?11775、銅綠假單胞菌Pse
6.根據權利要求1-4任一項所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述方法還包括：利用固相介質捕獲所述dCas9-sgRNA-DNA復合物，得到捕獲后的固相介質；對所述固相介質進行清洗和純化，得到純化后的靶標DNA；
7.基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序系統，其特征在于，所述系統包括：
8.一種計算機設備，其特征在于，所述設備包括：存儲器和處理器；所述存儲器用于存儲程序指令；所述處理器用于調用程序指令，當程序指令被執行時，用于執行權利要求1-6任意一項所述的方法的步驟。
9.一種計算機可讀存儲介質，其特征在于，其上存儲有計算機程序，所述計算機程序被處理器執行時實現上述的權利要求1-6任意一項所述的方法的步驟。
10.一種權利要求1-6任一項所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕獲測序方法在制備DNA檢測、診斷及治療試劑中的應用。
...【技術特征摘要】
1.基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述靶序列包括：大于等于10kb的序列；
3.根據權利要求1所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述dcas9-sgrna復合物的獲取方法包括：
4.根據權利要求1所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述dcas9-sgrna復合物包括無核酸酶活性的cas9蛋白與sgrna結合形成的復合物；
5.根據權利要求1-4任一項所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕獲測序方法，其特征在于，所述包含有靶序列的dna序列來自以下任一種或幾種樣本：人源細胞、鮑曼不動桿菌acinetobacter?baumannii?atcc?19606、肺炎克雷伯菌klebsiella?pneumoniae?atcc43816、大腸桿菌escherichia?coli?atcc?11775、銅綠假單胞菌pseu...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王姣，張曉麗，鄧濤，常玉俊，朱修篁，蔚躍，趙麗倩，孫立超，
申請(專利權)人：北京博奧醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：
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