【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物技術工藝領域，具體涉及一種采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法及其應用。
技術介紹
1、由于抗生素的過度和不恰當使用日益普遍，病原菌正不斷進化出對抗生素的耐藥性特征，如何有效應對細菌對抗生素耐藥的問題，已成為現代醫學與獸醫學領域內亟待解決的關鍵挑戰之一。尋找安全性高、環境友好、效果好的抗菌劑是解決日益嚴重的抗生素耐藥性問題的主要途徑。
2、而噬菌體(phage)是廣泛存在于自然界中的原核生物病毒，數量巨大，種類繁多，是目前理想的天然抗菌劑。噬菌體對其宿主菌具有高效特異性的感染，并且不容易出現宿主抗性，這就大大地改善了抗生素導致的耐藥性問題，近年來噬菌體已應用于臨床疾病的治療，并具有良好的效果。
3、一般來說，不同噬菌體在裂解細菌的能力上存在差異，對于廣譜噬菌體來說，同一噬菌體裂解不同細菌的能力上也存在差異。因此，如何提升噬菌體的裂解能力是個難題，現今還未有較好的解決方案。
技術實現思路
1、本專利技術旨在針對現有技術的不足，提供一種采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法及其應用。本專利技術的目的在于提供采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，該方法克服了傳統的噬菌體生產發酵過程中對單一特定宿主菌的高度依賴，提高了噬菌體的發酵性能，提升了跨種屬裂解能力，拓寬了裂解譜，為噬菌體的發酵制備提供了一種可借鑒的普適性的新思路。
2、本專利技術上述目的通過以下技術方案實現：
3、第一方面，本專利技術提供了一種采用不同種屬宿主
4、(1)菌液的制備：分別挑取第一宿主大腸桿菌與第二宿主沙門氏菌單菌落于lb肉湯中，搖床培養，各自培養4～6h，備用；
5、(2)噬菌體的活化：將步驟(1)中獲得的第一宿主大腸桿菌和大腸桿菌噬菌體按照濃度比1：1加入lb肉湯中，置于搖床中，培養4～6h，離心，過濾除菌，備用；
6、(3)將步驟(2)活化后的大腸桿菌噬菌體和步驟(1)獲得的第一宿主大腸桿菌按照濃度比1：1，以1～2％的接種量加入lb肉湯中，于搖床中共培養20min～60min后，以1～2％的接種量添加步驟(1)獲得的第二宿主沙門氏菌，于搖床中培養，繼續發酵4～6h。優選的，添加的第二宿主沙門氏菌s11與第一宿主大腸埃希氏菌be-20261的濃度相同。
7、優選的，所述第一宿主大腸桿菌為大腸埃希氏菌(escherichia?coli)be-20261，其于2023年08月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.28217。
8、優選的，所述第二宿主沙門氏菌為沙門氏菌(salmonella?sp.)s11，其于2023年08月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.28220。通過實驗得到，在眾多沙門噬菌中，使用沙門氏菌s11作為宿主發酵的rdp-ec-20164效價最高，成斑情況最好，因此選擇沙門氏菌s11作為第二宿主沙門氏菌。
9、優選的，所述大腸桿菌噬菌體為大腸桿菌噬菌體(escherichia?colibacteriophage)rdp-ec-20164，其于2022年10月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.45369。電鏡觀測到：該噬菌體rdp-ec-20164頭部長度約為118.8nm，尾部長度為122.4nm，根據噬菌體分類學可知，屬于有尾噬菌體目中的肌尾病毒科。該噬菌體rdp-ec-20164為雙向裂解的噬菌體，可同時裂解沙門氏菌和大腸桿菌，具備跨種屬裂解能力。
10、優選的，所述步驟(3)中，添加第二宿主沙門氏菌之前，所述第一宿主大腸桿菌與大腸桿菌噬菌體共培養的條件為37℃，200rpm。在此條件下，微生物生長速度快。
11、優選的，所述步驟(3)中，添加第二宿主沙門氏菌之前，所述第一宿主大腸桿菌與大腸桿菌噬菌體共培養的時間為30min～40min。最優選的，所述步驟(3)中，添加第二宿主沙門氏菌之前，所述步驟(3)中第一宿主大腸埃希氏菌be-20261與大腸桿菌噬菌體rdp-ec-20164共培養的時間為30min。通過實驗得到，根據噬菌體rdp-ec-20164的一步生長曲線來確定第二宿主進沙門氏菌的添加時間，發現噬菌體rdp-ec-20164發酵30min～40min，其效價保持在105pfu/ml，效價低，為縮短發酵時間，優選噬菌體rdp-ec-20164培養30min時作為添加第二宿主沙門氏菌s11的時間。
12、優選的，所述步驟(3)中添加第二宿主沙門氏菌后的培養條件為37℃，200rpm。
13、第二方面，本專利技術提供了如上所述的發酵方法得到的噬菌體發酵產品。
14、優選的，所述噬菌體發酵產品中噬菌體的效價≥108pfu/ml，實驗證明，本專利技術可將噬菌體的產量從單一宿主的107pfu/ml，提升1個數量級，達到108pfu/ml，滿足大腸桿菌噬菌體的生產標準。
15、第三方面，本專利技術提供了如上所述的噬菌體發酵產品在制備生物殺菌劑中的應用，所述生物殺菌劑用于抑制或者清除大腸桿菌或者沙門氏菌。通過采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法得到的噬菌體，裂解能力得到提升，對大腸桿菌和沙門氏菌的可裂解范圍都有擴大；而且裂解性能穩定，經過反復發酵可保持良好的裂解能力。
16、本專利技術的有益效果是：
17、1、本專利技術提供的采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，通過在發酵過程中加入兩株不同種屬宿主菌生產同一株噬菌體的方法，刺激強化噬菌體的跨種屬裂解能力，提升噬菌體的裂解能力。
18、2、本專利技術以大腸桿菌噬菌體rdp-ec-20164，大腸埃希氏菌be-20261(屬：埃希氏菌屬；種：大腸桿菌)及沙門氏菌s11(屬：沙門氏菌屬；種：沙門氏菌)作為具體對象實施，且較比單一宿主發酵的常規發酵方法，可有效改善噬菌體發酵性能，可將噬菌體的產量從單一宿主的107pfu/ml，提升1個數量級，達到108pfu/ml。
19、3、本專利技術使用不同種屬的雙宿主菌發酵，不但可以提升噬菌體的殺菌能力，而且在反復發酵過程中能維持噬菌體裂解性能的穩定。
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1.一種采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，所述第一宿主大腸桿菌為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)BE-20261，其于2023年08月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.28217。
3.根據權利要求2所述的采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，所述第二宿主沙門氏菌為沙門氏菌(Salmonella?sp.)S11，其于2023年08月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.28220。
4.根據權利要求3所述的采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，所述大腸桿菌噬菌體為大腸桿菌噬菌體(Escherichia?coli?bacteriophage)RDP-EC-20164，其于2022年10月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.45369。
5.根
6.根據權利要求4所述的發酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中，添加第二宿主沙門氏菌之前，所述第一宿主大腸桿菌與大腸桿菌噬菌體共培養的時間為30min～40min。
7.根據權利要求4所述的發酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中添加第二宿主沙門氏菌后的培養條件為37℃，200rpm。
8.根據權利要求1～7任意一項所述的發酵方法得到的噬菌體發酵產品。
9.根據權利要求8所述的噬菌體發酵產品，其特征在于，所述噬菌體發酵產品中噬菌體的效價≥108pfu/mL。
10.根據權利要求8或者9所述的噬菌體發酵產品在制備生物殺菌劑中的應用，其特征在于，所述生物殺菌劑用于抑制或者清除大腸桿菌或者沙門氏菌。
...【技術特征摘要】
1.一種采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，所述第一宿主大腸桿菌為大腸埃希氏菌(escherichia?coli)be-20261，其于2023年08月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.28217。
3.根據權利要求2所述的采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，所述第二宿主沙門氏菌為沙門氏菌(salmonella?sp.)s11，其于2023年08月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.28220。
4.根據權利要求3所述的采用不同種屬宿主菌生產噬菌體的發酵方法，其特征在于，所述大腸桿菌噬菌體為大腸桿菌噬菌體(escherichia?coli?bacteriophage)rdp-ec-20164，其于2022年10月31日保藏于中國微生物菌種保...
【專利技術屬性】
技術研發人員：杜新永，劉軍偉，崔耐，馬如霞，王卿君，
申請(專利權)人：青島潤達生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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